Regulations and method validation requirements for rapid sterility test methods

發布時間(jian)：2023-09-20 15:58 信息來源：閱(yue)讀次數：次

無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫療器械、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。2020版中國藥典—《1101無菌檢查法》指出，無菌檢查包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性質允許，應采用薄膜過濾法。生物制品生產工藝、組成成分復雜，一般不能夠進行終端滅菌，因此，對生物制品進行嚴格的質量控制，是降低制品中外源因子或有毒雜質污染風險，保證生物制品安全有效的必要措施。

無菌檢查法實際包含3個部分的實驗，分別為：培養基適(shi)用性檢查(cha)、方法適(shi)用性試驗和供試品的(de)無菌檢查(cha)。

培養基適用性檢查主要目的有兩個，一是確認使用的培養基本身是無菌的，二是確認使用的培養基細菌或真菌是可以生長并且在規定時間內可以被觀察到，即靈敏性檢查。方法適用性試驗主要目的是判斷采用的方法，薄膜過濾法或者直接接種法，是否適用于要檢測的這種產品，方法適用性試驗可以與供試品的無菌檢查同時進行。藥典中從檢測數量、檢驗量、陰/陽性對照、接種要求、培養觀察和結果判讀全都進行了細致規定。關于無菌檢查法，美國、日本、歐洲藥典等基本實現藥典協調，這里重點對比中美法規對于供試品的無菌檢測要求差異。

隨著新型生物制品的(de)涌出(chu)，細胞制品的(de)普(pu)及，無菌檢查提出(chu)了(le)新要(yao)求。傳統培養(yang)方法(fa)因為(wei)至少需(xu)要(yao)14天的(de)培養(yang)時間才可以出(chu)結果，因此在時(shi)效性(xing)上無法(fa)滿足這些生物制品的放行(xing)檢需求(qiu)，也包括原(yuan)物料的質檢需求(qiu)。

關于無菌(jun)檢測替代(dai)方法的法規要(yao)求

laws and regulations

2020年版《中國藥(yao)典(dian)》第四部(bu)通則9201，藥(yao)品(pin)微生物檢驗替代方法驗證指導原則提出，隨著微生物學的迅速發(fa)展，制藥(yao)領(ling)域(yu)不斷引(yin)入了一些新的微生物檢驗技術，大體可分為(wei)三類：

① 基于微生物生長信息的(de)檢(jian)驗技術，如生物發光技術、電化學技術、比濁法等(deng)；

② 直接測定被測介質中(zhong)活微生(sheng)物的檢驗(yan)技術，如固相細胞(bao)(bao)計(ji)數(shu)法、流式(shi)細胞(bao)(bao)計(ji)數(shu)法等(deng)；

③ 基(ji)于微生物細胞(bao)所含有特定組(zu)成(cheng)成(cheng)分的(de)分析技術，如脂肪(fang)酸(suan)測定技術、核酸擴增技術、基因(yin)指紋分析(xi)技術等。

《CAR-T細胞治療產(chan)品(pin)質量控制檢測(ce)研究(jiu)(jiu)及非(fei)臨床(chuang)研究(jiu)(jiu)考慮(lv)要點》中提到，在可行的情(qing)況下，首(shou)選藥典(dian)方(fang)法用(yong)于無菌檢測(ce)，但考慮(lv)到Car-T細胞產(chan)品(pin)的特殊性，也鼓勵研究者開發快速的無菌檢測法，但應與藥典方法平行進行，在獲得(de)充分的比(bi)對數據后，結合無菌生產全(quan)過程的風險評(ping)估(gu)設(she)計(ji)放行策(ce)略，才有可能(neng)替(ti)代(dai)藥典方(fang)法。

USP<1071>Rapid microbial tests for release of sterile short-life products a risk-based aproach介紹了(le)有效期較短的(de)(de)無(wu)菌產(chan)品(pin)放行的(de)(de)快速微(wei)生物測試(shi)方(fang)法，包括ATP生物發光法、核(he)酸擴增法、流(liu)式等，并詳(xiang)細闡(chan)述了(le)這些替代(dai)方(fang)法的(de)(de)特點。

EP 2.6.21 Nucleic acid amplification techniques介紹了核酸擴增法可作為替代方法，并詳細(xi)闡述了該方法作為替代法需驗證的性(xing)能(neng)。

核酸(suan)qPCR方法適用(yong)范圍廣，具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短等特點，被廣泛應用于基因工程藥物的相關檢驗中。武漢珈創生物通過對樣本(ben)處理方(fang)法(fa)和相(xiang)關的(de)qPCR檢測(ce)方(fang)法(fa)進行充分驗證，獨立開(kai)發了(le)基于熒光探針qPCR方法的細菌/真菌快(kuai)速檢測方法，經(jing)驗證，該(gai)試劑(ji)盒與藥典方法具有可比性。

武漢珈創生物—細菌/真菌快(kuai)速檢測試劑盒

CANVEST qPCR Detection Kit

CANVEST® 細菌 qPCR 檢測試劑盒采用(yong)熒(ying)光探針 qPCR 技術，用(yong)于定(ding)性檢測細胞、細胞及基因治療產品以(yi)及(ji)其他(ta)生物制(zhi)品中是否(fou)有細(xi)菌(jun)的污染。

本試劑盒中的引物探針可以對多種細菌（覆蓋200種以上常見病原菌）進行特異性檢測，與真菌、支原體、昆蟲、人類及動物細胞（豬源細胞除外）不存在交叉反應。本試劑盒參照中國藥典 qPCR 方法檢測相關要求進行驗證，檢測限為100 CFU/mL。試劑盒中加入了內部控制系統，內部控制對照（IC）可在 PCR 擴增反應階段加入，以判斷待檢樣本對擴增反應是否存在抑制；也可在樣本提取階段加入，作為實驗整體對照，同時監測提取得率以及樣本中可能存在的 PCR 抑制情況。操作步驟簡單，可批量操作。

CANVEST® 真菌(jun) qPCR 檢測(ce)試劑(ji)盒主要適用于(yu)效(xiao)期短、批量小，無(wu)法保證在(zai)產品(pin)使用前完成放(fang)行檢(jian)查的細胞(bao)類制(zhi)品(pin)，也(ye)可用于(yu)檢(jian)測主細胞(bao)庫(ku)(ku)、工(gong)作細胞(bao)庫(ku)(ku)、病毒種子批是否(fou)有常見病原性真菌的污染。

本試劑盒中的引物探針可以對多種致病性真菌進行特異性檢測，與原核基因組、人等哺乳類動物基因組不存在交叉反應，其核酸檢測限為 1-5genome copies/reaction，同時參照《中國藥典》(ChP 9201)、《歐洲藥典》（EP 5.1.6）和《美國藥典》(UPS 1223) ，從專(zhuan)屬性(xing)(xing)、檢(jian)測性(xing)(xing)、等效(xiao)性(xing)(xing)、重現性(xing)(xing)和耐用性(xing)(xing)等 5 個方面進行了全面的驗證。操作簡單快捷，樣本丟失率低，還可降低試劑和操作過程中存在(zai)的污染風險(xian)

快速(su)微生物(wu)檢測的(de)相關法規

laws and regulations

美國(guo)藥(yao)典(dian)-USP<1071>RAPID MICROBIAL TESTS FOR RELEASE OF STERILE SHORT-LIFE PRODUCTS A RISK-BASED APPROACH(無菌短貨架期(qi)產品放(fang)行的快速微生物檢查法(fa): 依據風險(xian)評估的方法(fa))
美國藥典(dian)-USP<1223>VALIDATION OF ALTERNATIVE MICROBIOLOGICAL METHODS(微生物替(ti)代方法驗證(zheng)）
PDA TR33（中英文）-2013 可選擇的(de)和快速的(de)微生(sheng)物檢測方法的(de)評價驗證(zheng)與執行
美國藥典(dian)-USP [71] STERILITY TESTS無菌檢查
中國藥典—1101無菌檢查法
中國藥典—9201藥品(pin)微生物檢驗(yan)替代方法驗(yan)證指導原則
歐洲藥典EP.2.6.27 Microbiological Examination of Cell-based preparations (9.2)
CAR-T 細胞治療產品質量控制檢測研(yan)究及非(fei)臨床研(yan)究考慮要點(dian)
細(xi)胞類制(zhi)品微生物檢查法草案擬(ni)公示稿

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Regulations and method validation requirements for rapid sterility test methods