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發布時間：2022-10-24 17:32 信息來源： 閱讀次(ci)數(shu)： 次(ci)
外(wai)源性DNA屬于(yu)生物制品工(gong)藝(yi)相關雜質，對其含(han)量(liang)(liang)進行檢測可(ke)以(yi)確(que)(que)認產(chan)(chan)品純化工(gong)藝(yi)是(shi)否(fou)合(he)理(li)，即能否(fou)有效(xiao)去除(chu)外(wai)源DNA殘余；同(tong)時可(ke)確(que)(que)認產(chan)(chan)品中雜質含(han)量(liang)(liang)是(shi)否(fou)符合(he)標準(zhun)要求(qiu)，該(gai)檢測值是(shi)生物制品質量(liang)(liang)控(kong)制的重要參(can)數之一。
外源性DNA的來源
生產生物制品的宿主細胞（細菌、真菌和哺乳動物細胞）基因組，如E.coli、釀酒酵母、Vero細胞等；
生產用細胞攜帶的潛在病毒、包裝用病毒基因組或相關特定轉化序列，如逆轉錄病毒、輔助病毒、SV40大T抗原等；
質粒DNA，如包裝質粒或體外轉錄模板。
外源性DNA殘留的風險
感染性風險：整(zheng)合的或游(you)離的DNA病毒(du)(du)和反轉錄病毒(du)(du)的DNA在機體內外均具有感(gan)染性(xing)，感(gan)染后可(ke)產生感(gan)染性(xing)病毒(du)(du)粒子(zi)，其風(feng)險(xian)可(ke)能比致癌(ai)性(xing)風(feng)險(xian)更(geng)高。
致(zhi)癌性風險(xian)：現存的主要致癌機(ji)制是引入的顯性致癌基因（如真核生物中廣泛存在的ras基因），通過直接轉化使得部分正常細胞分化為瘤性細胞。
免疫原性(xing)風險(xian)：細菌基因組富(fu)含(han)的(de)CpG組分和(he)未(wei)甲(jia)基化修飾的(de)序列會刺(ci)激(ji)非特異(yi)性(xing)免疫反應(ying)，增加免疫原(yuan)性(xing)風險。
致突變性(xing)風險(xian)：哺乳動物(wu)細胞基(ji)因組中含(han)有(you)高拷貝數的轉座子，可(ke)通過異位(wei)重排改(gai)變基(ji)因組從而致突變。
外源性DNA殘(can)留的限定標(biao)準
《中國藥典》2020年(nian)版規定：細胞基質生(sheng)產的生(sheng)物制品(pin)DNA殘(can)留量(liang)不高于100 pg/劑、細菌或(huo)真菌基質生(sheng)產的制劑DNA殘(can)留量(liang)不超過(guo)10 ng/劑；
美國藥典：規(gui)定(ding)成品中殘留DNA不高于(yu)(yu)10 ng/劑、長度不大于(yu)(yu)200 bp；
歐洲藥(yao)典：規(gui)定殘留DNA不超過10 ng/劑，具體可接受(shou)限度需由權(quan)威機構批(pi)準。
后臺回復“外(wai)源性DNA殘留(liu)”，獲取相關法規原件。
外(wai)源性DNA殘留的檢測方法
DNA 探針雜交(jiao)法
根據檢測目標DNA設(she)計特異性探(tan)針，同位素(su)或(huo)熒光染(ran)料標記后與固定在膜上的變性DNA樣(yang)本(ben)雜交并顯現斑點，通(tong)過與DNA標準品信號值對比來估算樣(yang)本(ben)中DNA殘留量。
該方法優勢在于可通過電泳估計DNA分子大小，但缺點也很明顯，即實驗耗時長（48 h）。另外，若用同位素標記探針，靈敏度能達到pg級，但只能半定量檢測且有放射性污染風險；熒光染料標記探針能對DNA殘留進行定量檢測，但靈敏度有所降低。
熒光染色法
應(ying)用熒(ying)光染料(liao)picogreen與(yu)雙鏈DNA結合形成復合物，在(zai)480 nm激(ji)發光、520 nm接收光下檢測，在(zai)一定的(de)DNA濃(nong)度(du)范圍及熒(ying)光染料(liao)過量(liang)的(de)條件下熒(ying)光強度(du)與(yu)DNA濃(nong)度(du)成正比，根據熒(ying)光強度(du)計算樣本中(zhong)DNA殘留(liu)量(liang)。
該方法操作簡單、成本低廉、無需純化DNA；純DNA條件下靈敏度為0.2 ng/ml，基質中單鏈DNA和RNA對檢測影響較小，高濃度蛋白對檢測有干擾，故疫苗類產品經方法學驗證后是可以使用的，但不適用于高劑量的蛋白類制品；該方法對各類DNA具有通用性，無需對不同類型DNA設計特異性探針，但也因其特異性差易受環境中DNA污染。
定(ding)量PCR法
對(dui)外源性(xing)(xing)DNA設(she)(she)計特異性(xing)(xing)引物(wu)和熒(ying)光(guang)標記的(de)探(tan)針(zhen)，以反應體(ti)系(xi)中(zhong)熒(ying)光(guang)數(shu)值(zhi)反映特異性(xing)(xing)擴增產物(wu)量(liang)，當反應過(guo)程中(zhong)熒(ying)光(guang)強度達到預設(she)(she)的(de)閾值(zhi)時，體(ti)系(xi)的(de)PCR循(xun)環數(shu)與該體(ti)系(xi)所(suo)含(han)有(you)的(de)起始(shi)DNA模板量(liang)的(de)對(dui)數(shu)呈線性(xing)(xing)關系(xi)，依據(ju)DNA標準品測定樣(yang)本中(zhong)外源性(xing)(xing)DNA殘留(liu)量(liang)。
該方法序列特異性強、靈敏度高（fg級）、重現性好，是中國藥典、美國藥典和歐洲藥典均推薦的方法；靶標區域的選擇、引物和探針的特異性、DNA標準品質量對方法的靈敏度和準確度有較大影響，需針對不同外源性DNA開發特異的檢測體系和DNA標準品。
免(mian)疫閾值法
應用單(dan)鏈DNA結合(he)(he)蛋白捕獲變性(xing)的單(dan)鏈DNA，然后(hou)用尿素(su)酶標記的抗(kang)-DNA抗(kang)體(ti)與結合(he)(he)的DNA反(fan)應，以尿素(su)酶水解尿素(su)后(hou)溶液pH變化反(fan)應體(ti)系(xi)中DNA含(han)量(liang)，經DNA標準品(pin)計算殘留(liu)DNA含(han)量(liang)。
該方法靈敏度高（1-3 pg），有標準化操作流程，但依賴單鏈DNA結合蛋白和抗-DNA單克隆抗體兩種蛋白與DNA的結合，費用較高且需片段不小于600 bp。
珈創(chuang)生物正致力于“外源性DNA殘留”檢測服務的開展，歡迎新老客戶前來咨詢。
參考文獻(xian)：
Xing Wang,Donna M. Morgan,Gan Wang, Ned M. Mozier1.Residual DNA Analysis in Biologics Development: Review of Measurement and Quantitation Technologies and Future Directions.Biotecnology
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