qPCR 實驗在分析 C_T 時常常遇到這幾類問題，比如：

• 復孔間(jian)重(zhong)復性(xing)差，是否都和操(cao)作(zuo)有(you)關(guan)？

• 無模板陰性對照出現 C_T 值時，目的基因的 C_T 值是否還能用？

• C_T 值很大該怎么辦？

今天就給大家分享下，在 qPCR 實驗中遇到關于 C_T 值的常見問題時該如何解決。

復孔間重復性(xing)差一般(ban)會(hui)有(you)以(yi)下(xia)兩種情況：

（1）C_T 值很大，如 C_T ≥ 30，重復性差屬于正常現象。該現象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機性，直接導致復孔間的 C_T 值差異較大。

解決方法：如果融解曲線沒有雜峰，無模板陰性對照同目的基因的 △C_T 值為 3 or 5 以上，那 C_T 值為準確的，可多設置幾個復孔，選擇重復性好的 C_T 值參與計算。

（2）C_T ＜30，重復性較差。這種情況一般(ban)同操作有(you)關(guan)。

解決辦法：從以下幾個方面進行問題的排查：① 加樣準(zhun)確度；② 移液器吸取液體的準(zhun)確度；③ 定期校準(zhun) qPCR 儀。

① 加樣準確度

• 避免小體積加樣，減少加樣誤差。可以將引物、SYBR Green Mix、ddH₂O 配置成混合體系，并且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液 cDNA 添加 1 μL，可以更改為原液 cDNA 稀釋 5 倍，添加 5 μL，使用 ddH₂O 補齊體系至 20 μL 即可。

• SYBR Green Mix、配(pei)置的混合體系需(xu)要混合均勻(yun)(yun)。從 -20 ℃ 冰箱拿出的試劑需(xu)要完全融化(hua)并上下顛倒(dao)徹底混勻(yun)(yun)；配(pei)置體系時(shi)，將(jiang)混在一起的 Mix 用移液器(qi)吹打混勻(yun)(yun)。

② 移液(ye)器吸取液(ye)體的(de)準確度(du)

• 移液(ye)器(qi)量程(cheng)定期校(xiao)準(zhun)，校(xiao)準(zhun)周期為 1 年。

• 購買與移液器配(pei)套的(de)槍(qiang)頭(tou)，若槍(qiang)頭(tou)與移液器不匹配(pei)，在吸(xi)取(qu)(qu)液體時易出現漏氣的(de)現象，導致(zhi)吸(xi)取(qu)(qu)量程(cheng)不準確。

• 在(zai)(zai)吸(xi)取(qu)相(xiang)同量(liang)程的液(ye)體體積(ji)時(shi)，注意(yi)觀察每次吸(xi)取(qu)液(ye)體在(zai)(zai)槍(qiang)頭內(nei)的液(ye)面高度是否一致。

③ 定(ding)期校準 qPCR 儀(yi)

• 一般 qPCR 儀校準周期為一年。

  
  

未(wei)完待續...

轉自：諾唯贊(zan)