4.  CART細胞結構

CAR結(jie)構包含(han)

1. 抗(kang)體的單鏈(lian)可變區(qu)（scFv）
2. 非信號胞外區
3. 與scFv鏈接的鉸鏈區
4. 跨膜(mo)區(qu)
5. T細胞受體胞內CD3ζ區
6. 共刺激因子結構域

四代CAR的發展

• 第(di)一(yi)代CART誘導T細(xi)胞激活(huo)僅通過cd3ζ信號域(yu)激活(huo)
• 第二代CART中增(zeng)加了共刺激結構(gou)域
• 第三代CART增加兩個(ge)共刺(ci)激結構域(yu)
• 第(di)四代CART增加酶、細胞因子和(he)共刺(ci)激配體

5.  T細胞擴增

在(zai)CART細胞擴增過程中，細胞數量不斷增加(jia)，培養基體積增大(da)，必(bi)須(xu)通過更多或更大(da)的(de)組織培養瓶，這極大(da)地(di)復雜化(hua)了制造(zao)過程，并且它無法實現大(da)規(gui)模的(de)生產(chan)。

靜(jing)態培(pei)養袋，允(yun)許(xu)較少(shao)的手動開放處(chu)理(li)，管道(dao)連接(jie)可(ke)以使(shi)其在(zai)無菌條(tiao)件(jian)下進行。

另一種方法(fa) 使(shi)用生(sheng)物(wu)(wu)反(fan)(fan)應器，如Xuri細(xi)胞擴增系統和Wave生(sheng)物(wu)(wu)反(fan)(fan)應器系統，利用灌(guan)注機制添加營養(yang)物(wu)(wu)質以及去除生(sheng)長抑制物(wu)(wu)質，從而簡化了制造過程。

6.  細胞因子刺激

細(xi)胞(bao)因子在工藝中使用(yong)，作(zuo)為刺(ci)激(ji)信號(hao)，對于CART細(xi)胞(bao)質量，表型(xing)等產生重要影響。主(zhu)要是(shi)γ鏈細(xi)胞(bao)因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用(yong)IL-2 或(huo)者IL-7,同時使用(yong)/或(huo)者不(bu)適用(yong)IL-15.

諾華Yescarta使用IL-2，但是IL-2會導(dao)致分化(hua)和耗竭的T細(xi)胞(bao)表型。IL-7/IL-15可以增(zeng)(zeng)強T細(xi)胞(bao)活化(hua)和增(zeng)(zeng)殖，二者聯合使用可以增(zeng)(zeng)加(jia)未分化(hua)CART（TN，TSCM）的存活和維持。單獨添加(jia)IL-15也(ye)會增(zeng)(zeng)加(jia)耗竭表型，及抗(kang)凋亡活性。

和(he)(he)IL-2和(he)(he)IL-15比(bi)較，IL-21可以增(zeng)加(jia)(jia)CD62L表達，增(zeng)加(jia)(jia)抗(kang)腫瘤活性。

7.  抑制(zhi)特(te)定的信號通路

主要靶(ba)向(xiang)GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：

• GSK3β阻斷T細胞分化，產生更多的TSCM

• mTOR inhibitor rapamycin增(zeng)加CD62L表達(da)

• 體外AKT抑制劑(ji)也表現出增(zeng)加T細胞抗腫瘤活(huo)性

• PI3K抑制劑idelalisib，降低調節性T細胞，逆轉腫瘤免疫耐受，增加低分化CART細胞數量

8. 冷凍(dong)保存(cun)

冷凍保存CART細(xi)胞長達(da)90天，不影響細(xi)胞的活(huo)力。使(shi)用前37℃過夜，可以恢復CART細(xi)胞活(huo)力。