国产色视频免费,97久久香蕉国产线看观看,亚洲精品国产成人,无套内谢老熟女,精品亚洲麻豆1区2区3区

珈創(chuang)生物 —— 生物技術服務與研發為(wei)一體的(de)高新(xin)技術企業

優質高效透(tou)明

High quality, efficient and transparent

CAR-T生產工藝流程及優化考量（上）

發布時間：2020-08-11 13:13 信息來源： 閱讀次數： 次

細胞毒性CD8+CART細胞，直接介導腫瘤細胞清除，但是CD4+輔助細胞(Th細胞)同樣有著重要作用。CD4+和CD8+CART應該有一個合適的比例，有報道，治療B-ALL中，1：1會獲得產生更好的腫瘤消退療效。



調節性T細胞浸潤到實體腫瘤局部，會降低CD28-CD3ζ信號通路活性。去除CD28CAR胞內段的Lck結合結構域，即使在調節性T細胞存在的情況下，也有強抗腫瘤活性。

低分化的初始樣T細胞（na?ve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干細胞記憶樣T細胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更強的增殖能力和自我更新能力，以及分化為效應和記憶T細胞的能力，因而有產生更好臨床結果的潛能，更持久的抗腫瘤活性。

而分化的(de)效應樣T細(xi)胞（T effector-like cells，TEff cells，表型(xing)CD45RA+ CCR7-)雖(sui)然體(ti)(ti)外表現(xian)初強的(de)抗腫瘤活(huo)性(xing)，但是在體(ti)(ti)內，活(huo)化和增(zeng)殖等能力均(jun)受(shou)損。

腫瘤高(gao)表(biao)達(da)免(mian)(mian)疫檢(jian)查點配(pei)體，免(mian)(mian)疫細胞高(gao)表(biao)達(da)免(mian)(mian)疫檢(jian)查點受體，則(ze)病人對于CART缺乏應(ying)答。

T細胞需要表達淋巴組織歸巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸潤到腫瘤局部，起到更好的治療效果。如上文，TN和TSCM表達歸巢受體，而Teff不表達歸巢受體。高表達CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸潤到腫瘤組織。


image.png

image.png

1.  細胞分離和富集



分離方法：傳統方法Ficoll密度梯度離心用于去除顆粒細胞、紅細胞和血小板；自動化的分離系統：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。
基于CD3+進行細胞分選，然后以磁珠為基礎的技術如CliniMACS Prodigy，使用(yong)anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分選或者(zhe)去(qu)除特定的細胞群，以(yi)獲(huo)得(de)合理比例的CD4：CD8。

特(te)定未分化的(de)TN，TSCM，TCM細胞對于臨床是有益的(de)，但是分選流程復雜，在實際生產流程中有一定困(kun)難。


2.  T細胞激活



2.1anti-CD3/anti-CD28抗體活化
使用抗CD3（OKT-3單克隆抗體）/抗CD28抗體包被磁珠作為人工抗原提呈顆粒，anti-CD3提供增殖信號，anti-CD28提供共刺激信號。活化(hua)之(zhi)后，磁珠可被磁鐵(tie)去除掉。

和可溶性OKT-3抗體相比，抗體包被磁珠活(huo)化細(xi)胞，具有更(geng)(geng)少(shao)的分化，更(geng)(geng)少(shao)衰老的特(te)點。另外富集和清洗細(xi)胞會更(geng)(geng)加簡單，昂(ang)貴抗體的丟失(shi)更(geng)(geng)少(shao)。因而磁珠法是生產工藝中(zhong)最常用的方(fang)法，如(ru)諾(nuo)華的Kymriah。

最近一種(zhong)特殊的聚合物納米基體產品(pin)(T Cell TransAct)，上面結合有人源化CD3和CD28抗體，結合使用無血清培養基(TexMACS)，用于T細胞活化。這種方法增加了高表達CD62L，CCR7的 TCM細胞，減少CD57+耗竭T細胞，但是不改變PD-1的表達和基因轉染效率，而且細胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin
Retronectin是另外一種活化策略，使用重組纖維連接片段，同時可以增加逆轉錄病毒的感染效率。Retronectin和板結合CD3抗體，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特異性CART和CD19特異性CART，增加TN和TSCM的比例。但是T細胞活化弱，擴增弱，細胞因子分泌少等是缺點。

2.3 人工APC細胞

人工APC遞(di)呈(cheng)TAA給CART，使(shi)(shi)其活化。比(bi)如使(shi)(shi)用K-562同時表達TAA和共刺激分子，不表達HLA-A，HLA-B，僅可用于TAA特異性(xing)CART活化。

3.  基(ji)因轉(zhuan)導(dao)系統

3.1病毒(du)轉導(dao)

病(bing)毒(du)(du)轉(zhuan)染(ran)(ran)系統轉(zhuan)染(ran)(ran)效率高，最(zui)常用(yong)的是逆轉(zhuan)錄病(bing)毒(du)(du)載(zai)體(ti)和慢(man)病(bing)毒(du)(du)載(zai)體(ti)。逆轉(zhuan)錄病(bing)毒(du)(du)將病(bing)毒(du)(du)DNA整合(he)到宿主(zhu)DNA中(zhong)，產生穩(wen)定(ding)的轉(zhuan)染(ran)(ran)。慢(man)病(bing)毒(du)(du)需要調節基(ji)因來中(zhong)和宿主(zhu)細胞的防(fang)御(yu)，削弱免疫反(fan)應，以(yi)及調節病(bing)毒(du)(du)復(fu)制(zhi)。慢(man)病(bing)毒(du)(du)載(zai)體(ti)，插入(ru)誘變和致癌(ai)的風險很(hen)低。

逆轉(zhuan)錄病毒(du)生產(chan)(chan)需(xu)(xu)要大量的(de)包裝細胞，而慢病毒(du)載體生產(chan)(chan)需(xu)(xu)要大量質(zhi)粒DAN進行(xing)瞬時轉(zhuan)染(ran)。病毒(du)的(de)生產(chan)(chan)需(xu)(xu)要GMP級別的(de)生產(chan)(chan)車間(jian)和(he)一(yi)系(xi)列(lie)的(de)檢測方法，是病毒(du)轉(zhuan)染(ran)細胞最(zui)大瓶頸。

諾華的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和(he) 施(shi)貴(gui)寶Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用(yong)慢病毒載體。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用(yong)逆轉錄(lu)病毒。

3.2 基于質粒的基因傳遞

轉(zhuan)座(zuo)子/轉(zhuan)座(zuo)酶(mei)(mei)系(xi)統是(shi)一種替代的非(fei)病毒基因傳遞策(ce)略。采(cai)用(yong)“睡美人”轉(zhuan)座(zuo)子/轉(zhuan)座(zuo)酶(mei)(mei)系(xi)統進行CART制造。該系(xi)統由兩個DNA質粒組成(cheng)，一個編碼CAR，第二表(biao)達轉(zhuan)座(zuo)酶(mei)(mei)，這是(shi)切除和插入(ru)轉(zhuan)基因所必需的。這種方法不需要GMP車間生產病毒，成(cheng)本低。在(zai)第一代CART和第三代CART中被使(shi)用(yong)，產品已經開始在(zai)臨床實(shi)驗(yan)中使(shi)用(yong)。

3.3 基因編輯

CRISPR/Cas9能夠特(te)異性地破壞多個基(ji)(ji)因的基(ji)(ji)因組基(ji)(ji)因座(zuo)。CRISPR/Cas9系統結合腺相關病毒(du)(AAV)載體，將(jiang)CAR的DNA整(zheng)合入T細(xi)胞受體a，提高T細(xi)胞效力，抑制T細(xi)胞分化和衰竭。使用基(ji)(ji)因編輯和慢病毒(du)轉導，用于(yu)產生PD-1缺陷(xian)的CD19特(te)異性CART，增強(qiang)抗腫瘤活性。



上一篇：CAR-T生產工藝流程及優化考量（下） 下一篇：干貨 | qPCR 實驗中關于 CT 值問題的詳細攻略（下）