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CAR-T生產工藝流程及優化考量（上）

發布時間：2020-08-11 13:13 信息(xi)來源(yuan)： 閱(yue)讀次數：  次

細胞毒性CD8+CART細胞，直接介導腫瘤細胞清除，但是CD4+輔助細胞(Th細胞)同樣有著重要作用。CD4+和CD8+CART應該有一個合適的比例，有報道，治療B-ALL中，1：1會獲得產生更好的腫瘤消退療效。



調節性T細胞浸潤到實體腫瘤局部，會降低CD28-CD3ζ信號通路活性。去除CD28CAR胞內段的Lck結合結構域，即使在調節性T細胞存在的情況下，也有強抗腫瘤活性。

低分化的初始樣T細胞（na?ve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干細胞記憶樣T細胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更強的增殖能力和自我更新能力，以及分化為效應和記憶T細胞的能力，因而有產生更好臨床結果的潛能，更持久的抗腫瘤活性。

而(er)分化的效應樣T細胞（T effector-like cells，TEff cells，表型CD45RA+ CCR7-)雖然體(ti)(ti)外表現初強的抗腫瘤活性，但是在體(ti)(ti)內，活化和增殖等(deng)能力均受損。

腫瘤(liu)高表(biao)達免疫檢查點(dian)配體，免疫細胞高表(biao)達免疫檢查點(dian)受體，則(ze)病人對(dui)于CART缺乏應答。

T細胞需要表達淋巴組織歸巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸潤到腫瘤局部，起到更好的治療效果。如上文，TN和TSCM表達歸巢受體，而Teff不表達歸巢受體。高表達CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸潤到腫瘤組織。


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1.  細胞分離和富集



分離方法：傳統方法Ficoll密度梯度離心用于去除顆粒細胞、紅細胞和血小板；自動化的分離系統：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。
基于CD3+進行細胞分選，然后以磁珠為基礎的技術如CliniMACS Prodigy，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁(ci)珠分選或者去(qu)除特定的細胞群，以獲得合理比例的CD4：CD8。

特定未分(fen)化的(de)TN，TSCM，TCM細胞對于臨床(chuang)是(shi)有益的(de)，但是(shi)分(fen)選流程復雜，在實(shi)際生產流程中(zhong)有一(yi)定困難(nan)。


2.  T細胞(bao)激(ji)活



2.1anti-CD3/anti-CD28抗(kang)體活(huo)化
使用抗CD3（OKT-3單克隆抗體）/抗CD28抗體包被磁珠作為人工抗原提呈顆粒，anti-CD3提供增殖信號，anti-CD28提供共刺激信號。活化之后(hou)，磁珠可被磁鐵去除掉。

和(he)可(ke)溶性OKT-3抗體相(xiang)比，抗體包(bao)被(bei)磁珠活(huo)化細胞，具有更(geng)少的分化，更(geng)少衰老的特點。另外富集和(he)清洗細胞會更(geng)加簡(jian)單，昂貴抗體的丟失更(geng)少。因而磁珠法(fa)是(shi)生產工(gong)藝中最(zui)常用的方法(fa)，如諾華(hua)的Kymriah。

最近(jin)一種特(te)殊的聚合(he)物納米基體(ti)產品(pin)(T Cell TransAct)，上面(mian)結合(he)有人源化CD3和CD28抗體，結合使用無血清培養基(TexMACS)，用于T細胞活化。這種方法增加了高表達CD62L，CCR7的 TCM細胞，減少CD57+耗竭T細胞，但是不改變PD-1的表達和基因轉染效率，而且細胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin
Retronectin是另外一種活化策略，使用重組纖維連接片段，同時可以增加逆轉錄病毒的感染效率。Retronectin和板結合CD3抗體，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特異性CART和CD19特異性CART，增加TN和TSCM的比例。但是T細胞活化弱，擴增弱，細胞因子分泌少等是缺點。

2.3 人工APC細胞

人工APC遞呈TAA給CART，使其活(huo)化。比如使用(yong)(yong)K-562同時(shi)表(biao)達(da)(da)TAA和共刺激分(fen)子，不表(biao)達(da)(da)HLA-A，HLA-B，僅可用(yong)(yong)于TAA特(te)異(yi)性CART活(huo)化。

3.  基因轉導系統

3.1病毒轉導

病毒轉(zhuan)染(ran)系統(tong)轉(zhuan)染(ran)效率高(gao)，最常用的(de)是(shi)逆轉(zhuan)錄(lu)(lu)病毒載(zai)體(ti)(ti)和(he)慢病毒載(zai)體(ti)(ti)。逆轉(zhuan)錄(lu)(lu)病毒將病毒DNA整合到宿主DNA中，產生(sheng)穩定的(de)轉(zhuan)染(ran)。慢病毒需(xu)要(yao)調節基因來中和(he)宿主細胞的(de)防御，削弱免(mian)疫反應，以及調節病毒復制(zhi)。慢病毒載(zai)體(ti)(ti)，插入誘變(bian)和(he)致癌(ai)的(de)風險很低。

逆轉錄(lu)病(bing)毒(du)生產需要(yao)大(da)(da)量的包(bao)裝細胞，而(er)慢病(bing)毒(du)載體生產需要(yao)大(da)(da)量質粒DAN進(jin)行瞬時(shi)轉染。病(bing)毒(du)的生產需要(yao)GMP級(ji)別的生產車間和(he)一系列的檢(jian)測方法，是病(bing)毒(du)轉染細胞最大(da)(da)瓶頸(jing)。

諾(nuo)華(hua)的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和 施貴寶Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使(shi)用慢病(bing)毒載體(ti)。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使(shi)用逆轉錄病(bing)毒。

3.2 基于質粒(li)的基因傳(chuan)遞

轉座子/轉座酶(mei)系統(tong)是(shi)一種(zhong)替代的非病毒(du)基因(yin)傳遞策略。采用(yong)“睡美人”轉座子/轉座酶(mei)系統(tong)進行CART制造(zao)。該系統(tong)由(you)兩個DNA質(zhi)粒組成(cheng)，一個編(bian)碼CAR，第二表達(da)轉座酶(mei)，這是(shi)切除和插(cha)入(ru)轉基因(yin)所(suo)必需的。這種(zhong)方法不(bu)需要GMP車(che)間(jian)生產病毒(du)，成(cheng)本低。在(zai)第一代CART和第三(san)代CART中被(bei)使用(yong)，產品已經開(kai)始在(zai)臨床實驗中使用(yong)。

3.3 基(ji)因編輯

CRISPR/Cas9能夠特(te)異(yi)性(xing)地破壞(huai)多(duo)個基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)座。CRISPR/Cas9系(xi)統(tong)結合腺相關病毒(AAV)載體，將CAR的(de)DNA整合入(ru)T細(xi)胞受體a，提高T細(xi)胞效力(li)，抑制(zhi)T細(xi)胞分化和(he)衰竭。使用(yong)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)編輯和(he)慢病毒轉(zhuan)導，用(yong)于產生PD-1缺陷(xian)的(de)CD19特(te)異(yi)性(xing)CART，增強抗腫(zhong)瘤(liu)活性(xing)。



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