CAR-T生產工藝流程及優化考量（上）

發布時間：2020-08-11 13:13 信息來源：閱讀次(ci)數：次(ci)

細胞毒性CD8+CART細胞，直接介導腫瘤細胞清除，但是CD4+輔助細胞(Th細胞)同樣有著重要作用。CD4+和CD8+CART應該有一個合適的比例，有報道，治療B-ALL中，1：1會獲得產生更好的腫瘤消退療效。

調節性T細胞浸潤到實體腫瘤局部，會降低CD28-CD3ζ信號通路活性。去除CD28CAR胞內段的Lck結合結構域，即使在調節性T細胞存在的情況下，也有強抗腫瘤活性。

低分化的初始樣T細胞（na?ve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干細胞記憶樣T細胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更強的增殖能力和自我更新能力，以及分化為效應和記憶T細胞的能力，因而有產生更好臨床結果的潛能，更持久的抗腫瘤活性。

而(er)分(fen)化(hua)(hua)的效應樣T細(xi)胞(bao)（T effector-like cells，TEff cells，表(biao)型(xing)CD45RA+ CCR7-)雖然(ran)體外表(biao)現初(chu)強的抗腫(zhong)瘤活性(xing)，但(dan)是(shi)在體內，活化(hua)(hua)和增殖(zhi)等能力均受損。

腫(zhong)瘤高表(biao)達(da)免(mian)疫檢查點配體，免(mian)疫細胞高表(biao)達(da)免(mian)疫檢查點受體，則病人(ren)對(dui)于CART缺乏(fa)應答。

T細胞需要表達淋巴組織歸巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸潤到腫瘤局部，起到更好的治療效果。如上文，TN和TSCM表達歸巢受體，而Teff不表達歸巢受體。高表達CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸潤到腫瘤組織。

1. 細胞分離和富集

分離方法：傳統方法Ficoll密度梯度離心用于去除顆粒細胞、紅細胞和血小板；自動化的分離系統：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。

基于CD3+進行細胞分選，然后以磁珠為基礎的技術如CliniMACS Prodigy，使用(yong)anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分(fen)選(xuan)或者去除特定的(de)細胞群，以獲得(de)合理比例(li)的(de)CD4：CD8。

特定(ding)未分化的TN，TSCM，TCM細胞對于(yu)臨床是(shi)有益的，但是(shi)分選流(liu)程(cheng)復雜，在實際生產流(liu)程(cheng)中有一定(ding)困難。

2. T細(xi)胞激(ji)活

2.1anti-CD3/anti-CD28抗體活(huo)化

使用抗CD3（OKT-3單克隆抗體）/抗CD28抗體包被磁珠作為人工抗原提呈顆粒，anti-CD3提供增殖信號，anti-CD28提供共刺激信號。活化之(zhi)后，磁(ci)(ci)珠可被磁(ci)(ci)鐵(tie)去(qu)除掉(diao)。

和可溶性OKT-3抗體相比，抗體包被磁珠活化(hua)細(xi)胞(bao)，具有更少(shao)(shao)的(de)分化(hua)，更少(shao)(shao)衰老的(de)特點。另外(wai)富集和清洗細(xi)胞(bao)會更加(jia)簡(jian)單(dan)，昂貴抗體的(de)丟失(shi)更少(shao)(shao)。因而磁珠法(fa)是生產(chan)工藝中最常用的(de)方法(fa)，如諾華的(de)Kymriah。

最近一種特殊的聚合(he)物納米基體產(chan)品(T Cell TransAct)，上面(mian)結合(he)有人源化CD3和CD28抗體，結合使用無血清培養基(TexMACS)，用于T細胞活化。這種方法增加了高表達CD62L，CCR7的 TCM細胞，減少CD57+耗竭T細胞，但是不改變PD-1的表達和基因轉染效率，而且細胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin

Retronectin是另外一種活化策略，使用重組纖維連接片段，同時可以增加逆轉錄病毒的感染效率。Retronectin和板結合CD3抗體，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特異性CART和CD19特異性CART，增加TN和TSCM的比例。但是T細胞活化弱，擴增弱，細胞因子分泌少等是缺點。

2.3 人工(gong)APC細胞

人工APC遞呈TAA給CART，使(shi)其活化。比如(ru)使(shi)用(yong)K-562同(tong)時(shi)表(biao)達TAA和(he)共刺(ci)激分子，不(bu)表(biao)達HLA-A，HLA-B，僅可用(yong)于(yu)TAA特異性(xing)CART活化。

3. 基因轉(zhuan)導系統

3.1病毒轉導

病(bing)毒(du)(du)(du)轉(zhuan)染(ran)(ran)系統(tong)轉(zhuan)染(ran)(ran)效率(lv)高(gao)，最常用的(de)(de)是逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體和慢病(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體。逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)(du)(du)將病(bing)毒(du)(du)(du)DNA整合到(dao)宿主(zhu)(zhu)DNA中，產(chan)生穩定的(de)(de)轉(zhuan)染(ran)(ran)。慢病(bing)毒(du)(du)(du)需要(yao)調節(jie)基因來(lai)中和宿主(zhu)(zhu)細(xi)胞的(de)(de)防御，削弱免疫(yi)反應，以(yi)及調節(jie)病(bing)毒(du)(du)(du)復制。慢病(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體，插入誘(you)變和致癌的(de)(de)風(feng)險(xian)很低(di)。

逆轉(zhuan)錄病(bing)(bing)毒生產(chan)需要大(da)量的包裝細胞，而慢病(bing)(bing)毒載(zai)體生產(chan)需要大(da)量質粒DAN進行瞬(shun)時轉(zhuan)染(ran)。病(bing)(bing)毒的生產(chan)需要GMP級別的生產(chan)車間和一系列的檢測方法，是病(bing)(bing)毒轉(zhuan)染(ran)細胞最大(da)瓶(ping)頸。

諾華的(de)Kymriah® (Tisagenlecleucel)和施貴寶Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用(yong)慢病毒載體。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用(yong)逆轉錄(lu)病毒。

3.2 基于質粒的基因(yin)傳遞

轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)子(zi)/轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)酶系統(tong)(tong)是(shi)一(yi)種替代(dai)的非(fei)病(bing)毒基因傳遞策略。采用(yong)(yong)(yong)“睡美人”轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)子(zi)/轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)酶系統(tong)(tong)進行CART制(zhi)造。該系統(tong)(tong)由(you)兩個DNA質(zhi)粒組成(cheng)，一(yi)個編碼CAR，第(di)二(er)表達轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)酶，這是(shi)切(qie)除(chu)和插入轉(zhuan)(zhuan)基因所必需(xu)的。這種方法不需(xu)要GMP車間生產病(bing)毒，成(cheng)本低(di)。在(zai)第(di)一(yi)代(dai)CART和第(di)三代(dai)CART中(zhong)(zhong)被使(shi)用(yong)(yong)(yong)，產品已經(jing)開始(shi)在(zai)臨床實驗中(zhong)(zhong)使(shi)用(yong)(yong)(yong)。

3.3 基因編輯

CRISPR/Cas9能夠特(te)異性地破(po)壞多個基(ji)因(yin)的基(ji)因(yin)組基(ji)因(yin)座。CRISPR/Cas9系統結(jie)合腺相關病毒(AAV)載體，將CAR的DNA整合入T細胞受體a，提高(gao)T細胞效力，抑制T細胞分化和衰(shuai)竭。使(shi)用基(ji)因(yin)編輯和慢病毒轉導，用于(yu)產生PD-1缺陷的CD19特(te)異性CART，增強抗(kang)腫(zhong)瘤活(huo)性。

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