根據治(zhi)療(liao)細胞的類型，我們大致(zhi)可以分(fen)為(wei)免疫細胞和干(gan)細胞，如下圖所示。

CAR-T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)治療(liao)是一(yi)種以(yi)患者(zhe)(zhe)自身T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)為基礎(chu)的(de)治療(liao)，通過白細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)離術收集患者(zhe)(zhe)的(de)外(wai)周血單核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（PBMC細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao))，再分(fen)離出特定的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)亞群(qun)，如(ru)CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。分(fen)離出的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)起始亞群(qun)需要持續(xu)和充分(fen)的(de)激活(huo)才能實現體外(wai)擴增，這(zhe)就需要通過T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)受體信(xin)(xin)號(hao)和CD28、4-1BB或OX40信(xin)(xin)號(hao)等共刺激信(xin)(xin)號(hao)產(chan)生主要的(de)特異性(xing)信(xin)(xin)號(hao)，從而(er)激活(huo)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。再通過電穿(chuan)孔、慢病毒(du)或逆轉錄(lu)病毒(du)載體，將CAR基因(yin)(yin)導入(ru)激活(huo)的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)進行(xing)基因(yin)(yin)修飾，從而(er)得到可表達(da)CAR基因(yin)(yin)的(de)CAR-T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（如(ru)下圖所示(shi)為整個CAR-T生產(chan)的(de)流程）。

曾有報道，作為兩家CAR-T原研藥生產廠家，諾華的Kymriah和Kite制藥的Yescarta在早期CAR-T制備的失敗率都比較高，而這些失敗的原因中除了病人因為個體差異而導致失敗外，制備得到的CAR-T細胞質量和數量也是很重要的因素。

3.1 T細(xi)胞刺激后體(ti)積監(jian)控的(de)重要性(xing)

由Springer（施普林格科學）公司于2017發行，題為Methods in Molecular Biology - Acute Myeloid Leukemia - Methods and Protocols （分子生物學方法 -急性髓細胞白血病-方法和方案）的參考標準方法流程中，刊登了一篇名為Generating and Expanding Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cells from Patients with Acute Myeloid Leukemia，的文章（如左下圖），由幾位著名的T細胞高手(Saad S. Kenderian, Carl H. June, 和 Saar Gill)編寫的急性髓細胞白血病自體Car-T細胞的生成和擴增方法。

在3.1的＂從AML患者(zhe)擴增(zeng)T細(xi)(xi)胞＂過程，由刺激日起計(ji)的第3天，每隔1天要進(jin)行(xing)細(xi)(xi)胞計(ji)數，保持細(xi)(xi)胞在1x10⁶細胞/mL。第6天磁(ci)珠轉移后，也需要進行細胞計數。

除了細(xi)(xi)胞(bao)(bao)計(ji)數外(wai)，還要通過庫爾特計(ji)數和(he)粒度分析(xi)儀(yi)Multisizer來記錄平(ping)均細(xi)(xi)胞(bao)(bao)體積（MCV），因(yin)MCV上(shang)升等于T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)被激活，而在被激活后的第5-7天達到(dao)最大。然后隨著T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)開(kai)始(shi)休(xiu)息(xi)而下降。當(dang)MCV變為300 fL（通常在第9-14天范圍）時(shi)表明細(xi)(xi)胞(bao)(bao)得到(dao)了充分休(xiu)息(xi)，可(ke)以進行后續的冷藏(zang)或測試（如右下圖）。

通過監測T細胞的體積，比較不同CAR-T細胞及T細胞的平均體積差異，比較培養激活過程中的體積變化，幫助判斷細胞何時到靜息/穩定狀態，另外幫助判斷細胞的激活強度，為研究做出科學判斷或決定下一步操作，如后期的功能檢測或冷凍保存等。

那么為何庫爾特法的Multisizer可以準確地給出T細(xi)胞激活后體積的變(bian)化值呢？這是因為庫爾特法的原理，以及Multisizer配備了數字脈沖處理器（DPP），庫爾特的原理是通過檢測單個細胞通過小孔時電壓的變化來精確記錄，并且換算得到每個細胞的體積，而配備的數字脈沖處理器，可以使得檢測的分辨率達到nm級別，所以可以對細胞體積的微小變化都能準確的記錄下來。

另外，如(ru)果采(cai)用(yong)傳統的(de)(de)(de)(de)顯微鏡(jing)或其他圖像法儀器觀察細(xi)(xi)胞體(ti)(ti)積(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化，不(bu)僅看到(dao)的(de)(de)(de)(de)是二維(wei)的(de)(de)(de)(de)圖，并不(bu)能(neng)真(zhen)正反(fan)映反(fan)映細(xi)(xi)胞整體(ti)(ti)真(zhen)實(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)積(ji)(ji)大小。并且細(xi)(xi)胞體(ti)(ti)積(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)微笑(xiao)變(bian)化，體(ti)(ti)積(ji)(ji)表征(zheng)相(xiang)對細(xi)(xi)胞直徑的(de)(de)(de)(de)表征(zheng)更(geng)加明顯。譬如(ru)，10um的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞，直徑變(bian)大了5%，由(you)于圖像法的(de)(de)(de)(de)分(fen)辨(bian)率差(cha)很(hen)難看出(chu)差(cha)異，但按體(ti)(ti)積(ji)(ji)計算，體(ti)(ti)積(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)增加能(neng)達到(dao)15.7%，加上Multisizer的(de)(de)(de)(de)DPP功能(neng)，可以實(shi)(shi)(shi)現所(suo)關注(zhu)粒徑范圍最多(duo)400個粒徑分(fen)析通道（如(ru)下(xia)圖所(suo)示），真(zhen)正實(shi)(shi)(shi)現高分(fen)辨(bian)地檢測體(ti)(ti)積(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化。

3.2 CAR-T細胞的數量和(he)活率監控

2019年(nian)在SCI Immunotherapy雜志發表了(le)一篇(pian)重磅文章《TREM1/Dap12-based CAR-T cells show potent antitumor activity》中描述，體外培養擴增(zeng)過程(cheng)中，除了(le)使(shi)用Multisizer來(lai)檢測(ce)細胞體積外，細胞數量和活率的檢測(ce)也(ye)一樣(yang)重要。

不同處理得到的CAR-T細胞擴增速率也是不同的，我們可以通過擴增時間的比較來檢查細胞生長狀態的好壞，以此幫助分析得到合適的細胞培養條件和細胞處理方法。

另外，對于進入(ru)生產(chan)化的(de)細胞產(chan)品，所有的(de)分析儀器都需要(yao)合規(gui)，包括來自FDA 21CFR Part11和(he)GMP生產(chan)要(yao)求，儀器操作要(yao)有多級(ji)管理權限，操作和(he)報錯都必須(xu)存(cun)有電子記(ji)錄，Vi-CELL BLU對已經(jing)考慮(lv)到(dao)了這些生產(chan)質(zhi)控的(de)要(yao)求，所以分析軟件都能符合這些規(gui)定。

CAR-T細胞免疫治療的(de)過程

CAR-T細(xi)(xi)胞免疫(yi)療法在近幾年來(lai)被越(yue)來(lai)越(yue)多大(da)眾所了解，也有(you)大(da)量的生(sheng)物制藥(yao)(yao)公司加入到CAR-T細(xi)(xi)胞免疫(yi)治療的隊伍，國(guo)(guo)(guo)外目前上市(shi)(shi)原(yuan)研藥(yao)(yao)還是(shi)諾華的Kymriah和被吉利(li)德收購德Kite制藥(yao)(yao)德Yescarta。而國(guo)(guo)(guo)內企業(ye)也在加緊(jin)研發和上市(shi)(shi)的步伐，其中(zhong)復(fu)興(xing)凱特和藥(yao)(yao)明(ming)巨諾分別在今年的2月和6月遞交了上市(shi)(shi)申請。如下是(shi)這幾家(jia)公司CAR-T研發生(sheng)產上市(shi)(shi)的進(jin)展表(biao)。其中(zhong)，作為國(guo)(guo)(guo)內龍頭之(zhi)一的南(nan)京傳(chuan)奇也在全力地推動產品的商業(ye)化(hua)，預計下半(ban)年會在美國(guo)(guo)(guo)遞交上市(shi)(shi)申請。