支原體能夠在特定的固體瓊脂培養基上形成經典的“油煎荷包蛋”式的菌落，因此可以在(zai)固(gu)體培(pei)養基上培(pei)養支原(yuan)體，通過觀察菌落形態以判斷是否存在(zai)支原(yuan)體污染。這(zhe)是(shi)最(zui)直觀(guan)的方法，也是(shi)最(zui)早的方法，但(dan)人(ren)們后(hou)來發現有很多支原(yuan)體難(nan)以在固體培(pei)養(yang)基上形(xing)成菌(jun)落(luo)，因此(ci)，該(gai)法容易造成假陰性結果。

支原體在液體培養基中也能夠較好地生長，在(zai)(zai)支原(yuan)體數目增(zeng)長(chang)到一(yi)定程(cheng)度之后(hou)，培養基中(zhong)的PH值會發生(sheng)顯著變化(hua)，如果在(zai)(zai)培養基中(zhong)添加指示劑，這種變化(hua)會非常直觀(guan)地顯現出來。

單純的液體培養基檢測經常受到指示劑加入量、變色范圍較小等因素的干擾。因此液(ye)體(ti)培養法(fa)和固體(ti)培養法(fa)通常一起(qi)使用，使檢測結果更加可靠。培養法的檢(jian)測時間在28天左右(you)，時間較長。

大多數支原體的DNA中AT堿基的含量較高（55%~80%），DNA熒光染料Hoechst 33258或DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以結合到AT含量較高的DNA鏈上。所以在(zai)使用熒光染(ran)料染(ran)色后(hou)，被支原體污染的指示細胞除了細胞核發出熒光外，細胞表面、周圍培養基和培養皿中也含有熒光小點。

為防止檢測結果出現細胞破裂后散出DNA等不確定因素造成假陽性或不清晰的實驗結果，通常會(hui)使(shi)用待(dai)檢測樣品(pin)的培養液(ye)，去感染易使(shi)支原(yuan)體(ti)增殖的指示細胞（無污(wu)染(ran)的Vero細(xi)胞或經藥(yao)品檢(jian)定機構認可的其(qi)他細(xi)胞），故又(you)稱指示(shi)細(xi)胞法。

對于細胞粘附性比較差的支原體（精氨酸類支原體），染色法的檢出效果較差，所以在實際(ji)檢測過程中通常將(jiang)染色法和培養法結合起來進(jin)行結果(guo)判定。

注：對(dui)可能(neng)引起指示細胞病變的且(qie)缺少有(you)效中(zhong)和抗(kang)體的高(gao)滴(di)度病毒樣本來說，不能(neng)使用DNA染色法進(jin)行檢(jian)測。

相較于其他PCR技術，實時熒光定量PCR法可(ke)以通過(guo)觀察熒光擴(kuo)增曲線的(de)擴(kuo)增情況(kuang)來(lai)實時檢測支(zhi)原(yuan)體的(de)污染情況(kuang)，具有較好的(de)特異性(xing)和準(zhun)確性(xing)。并且(qie)不(bu)需(xu)要(yao)在PCR擴增后再進行凝膠電(dian)泳，縮短了實驗時間，降低了交叉(cha)污染的(de)風險。

雖(sui)然支(zhi)原體(ti)核酸(suan)擴增檢(jian)測法(fa)彌補了培養(yang)法(fa)和(he)DNA染色法(fa)耗時長的(de)(de)(de)缺點，也在(zai)一定程度上增加了檢(jian)測的(de)(de)(de)靈敏度，但因(yin)其陽性(xing)檢(jian)出(chu)率往往受到(dao)引物所(suo)能(neng)擴增的(de)(de)(de)支(zhi)原體(ti)種類的(de)(de)(de)制約，且容易受到(dao)樣(yang)品核酸(suan)提取方法(fa)、與支(zhi)原體(ti)親(qin)緣關系較近(jin)的(de)(de)(de)基因(yin)干擾等外源因(yin)素的(de)(de)(de)影響。所(suo)以驗證每種支(zhi)原體(ti)核酸(suan)檢(jian)測方法(fa)的(de)(de)(de)檢(jian)測限(Detection Limit)、特異性(xing)(Specificity)、耐用性(xing)(Robustness)是(shi)非(fei)常必(bi)要的(de)(de)(de)。