1101無菌檢查法

無(wu)菌檢(jian)查(cha)法系用于(yu)檢(jian)查(cha)藥(yao)典要求無(wu)菌的(de)藥(yao)品(pin)、生物(wu)(wu)制品(pin)、醫(yi)療器 械 具(ju)、原料、輔(fu)料及(ji)其他品(pin)種(zhong)是否無(wu)菌的(de)一種(zhong)方法。若(ruo)供試品(pin)符合無(wu)菌檢(jian)查(cha)法的(de)規定,僅(jin)表明了(le)供試品(pin)在該檢(jian)驗條件下未發現微生物(wu)(wu)污染。

無菌(jun)檢(jian)(jian)查(cha)應(ying)(ying)在無菌(jun)條件下(xia)進行，試驗(yan)環境(jing)必須達到(dao)無菌(jun)檢(jian)(jian)查(cha)的(de)(de)要(yao)求(qiu)，檢(jian)(jian)驗(yan)全過程應(ying)(ying)嚴格遵守(shou)無菌(jun)操作，防(fang)止微生(sheng)(sheng)物(wu)污染，防(fang)止污染的(de)(de)措施不得影響 供試品(pin)中微生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)檢(jian)(jian)出。單向(xiang)流(liu)空氣(qi)區(qu)、工(gong)作臺面及受控環境(jing)應(ying)(ying)定期(qi)按醫藥工(gong)業(ye)潔凈室（區(qu)）懸浮(fu)粒子、浮(fu)游菌(jun)和沉(chen)降菌(jun)的(de)(de)測試方法的(de)(de)現行國(guo)家標準進行潔凈度確認。隔離(li)系統應(ying)(ying)定期(qi)按相關的(de)(de)要(yao)求(qiu)進行驗(yan)證，其內部環境(jing)的(de)(de)潔凈度須符合無菌(jun)檢(jian)(jian)查(cha)的(de)(de)要(yao)求(qiu)。日常檢(jian)(jian)驗(yan)還需(xu)對試驗(yan)環境(jing)進行監測。

培養基

硫乙醇(chun)酸鹽流(liu)體培(pei)(pei)養(yang)基主要用于(yu)厭氧(yang)菌(jun)(jun)的(de)培(pei)(pei)養(yang)，也可(ke)用于(yu)需氧(yang)菌(jun)(jun)培(pei)(pei)養(yang)；胰酪大豆胨液體培(pei)(pei)養(yang)基用于(yu)真菌(jun)(jun)和需氧(yang)菌(jun)(jun)的(de)培(pei)(pei)養(yang)。

培養基的制備及培養條件

培(pei)養基(ji)可按以下(xia)處(chu)方制(zhi)(zhi)備(bei)，亦可使用(yong)按該(gai)處(chu)方生產的(de)(de)符合規定的(de)(de)脫(tuo)水培(pei)養基(ji)或成(cheng)品培(pei)養基(ji)。配(pei)制(zhi)(zhi)后應采(cai)用(yong)驗證合格的(de)(de)滅(mie)菌(jun)程序(xu)滅(mie)菌(jun)。制(zhi)(zhi)備(bei)好的(de)(de)培(pei)養基(ji)。若不即(ji)時使用(yong)，應置于(yu)無菌(jun)密閉容器(qi)中，在(zai)(zai) 2～25℃、避光的(de)(de)環境下(xia)保存(cun)，并在(zai)(zai)經驗證的(de)(de)保存(cun)期內使用(yong)。

除葡(pu)萄糖(tang)和刃天(tian)青(qing)溶(rong)液(ye)外，取(qu)上述成分(fen)混(hun)合(he)，微溫溶(rong)解，調節(jie) pH 為弱堿性(xing)，煮沸，濾(lv)清，加入(ru)葡(pu)萄糖(tang)和刃天(tian)青(qing)溶(rong)液(ye)，搖勻(yun)，調節(jie) pH，使滅菌后(hou)在 25℃ 的 pH 值為 7.1±0.2。分(fen)裝至(zhi)適宜的容器(qi)中(zhong)，其裝量(liang)與容器(qi)高(gao)度的比例應符合(he)培養(yang)結(jie)束后(hou)培養(yang)基(ji)氧化(hua)層（粉紅色）不超過培養(yang)基(ji)深度的 1/2。滅菌在供(gong)試品接種前，培養(yang)基(ji)氧化(hua)層的高(gao)度不得超過培養(yang)基(ji)深度的 1/53，否則，須經100℃ 水浴加熱至(zhi)粉紅色消(xiao)失(shi)（不超過 20 分(fen)鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被(bei)污染。

除另(ling)有規定外，硫乙醇酸鹽(yan)流體培(pei)養基置 30～35℃培(pei)養。

2. 胰酪大豆胨液體培養基

胰酪(lao)胨 17.0g

大豆木瓜蛋(dan)白酶水解物 3.0g

葡萄糖(tang)/無水(shui)葡萄糖(tang) 2.5g/2.3g

氯(lv)化鈉 5.0g

磷酸(suan)氫二鉀 2.5g

水 1000ml

除葡萄糖(tang)外，取上述成分，混合，微溫溶解，必(bi)要時濾(lv)過使澄清，調節 pH 使滅菌后在 25℃的 pH 值為(wei) 7.3±0.2，加入葡萄糖(tang)，分裝(zhuang)，滅菌。

胰酪大豆(dou)胨液體培養基置 20～25℃培養。

3. 中和或滅活用培養基(ji)

按上述硫乙(yi)醇酸(suan)鹽流體培(pei)養基或胰酪大(da)豆胨液體培(pei)養基的處方及制法， 在培(pei)養基滅菌前(qian)或使用前(qian)加入適(shi)宜的中和劑、滅活劑或表面活性(xing)劑，其用量同方法適(shi)用性(xing)試驗。

4. 胰酪大豆胨瓊脂(zhi)培養(yang)基

胰酪(lao)胨 15.0g

大豆木瓜蛋白酶水(shui)解物 5.0g

氯化鈉 5.0g

瓊(qiong)脂 15.0g

水(shui) 1000ml

除瓊(qiong)脂外，取上述(shu)成(cheng)分(fen)，混合，微溫溶解，調(diao)節 pH 使滅菌后在 25℃的 pH 值為 7.3±0.2，加(jia)入瓊(qiong)脂，加(jia)熱(re)溶化后，搖(yao)勻，分(fen)裝，滅菌。

5. 沙(sha)氏葡萄糖液體培養基

動(dong)物(wu)組織胃蛋白酶水(shui)解物(wu)和胰酪胨等(deng)量混合物(wu) 10.0g

葡萄糖 20.0g

水 1000mL

除葡萄糖外(wai)，取上述成分(fen)，混合，微溫溶解，調節 pH 使滅(mie)菌(jun)后(hou)在 25℃的 pH 值為 5.6±0.2，加入(ru)葡萄糖，搖勻，分(fen)裝，滅(mie)菌(jun)。

6. 沙(sha)氏葡萄糖瓊脂培養基

動物(wu)組織(zhi)胃蛋白酶水解(jie)物(wu)和胰酪胨(dong)等(deng)量混(hun)合物(wu) 10.0g

葡萄糖 40.0g

瓊脂(zhi) 15.0g

水(shui) 1000mL

除葡萄糖、瓊(qiong)脂(zhi)外，取(qu)上述成分，混合，微溫溶解(jie)，調節 pH 使滅菌后在 25℃的 pH 值(zhi)為(wei) 5.6±0.2，加入(ru)瓊(qiong)脂(zhi),加熱溶化(hua)后, 再加入(ru)葡萄糖，搖勻(yun)，分 裝，滅菌。

7. 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）

馬鈴薯(去(qu)皮) 200g

葡萄(tao)糖(tang) 20.0g

瓊脂 14.0g

水 1000mL

取馬鈴薯，切成(cheng)小塊(kuai)，加(jia)水(shui) 1000mL，煮沸 20-30 分鐘，用(yong) 6-8 層紗(sha)布過 濾，取濾液補水(shui)至 1000ml，調節 pH 使滅菌后在 25℃的 pH 值為(wei) 5.6±0.2，加(jia)入瓊脂，加(jia)熱溶化(hua)后, 再加(jia)入葡萄糖(tang)，搖勻，分裝，滅菌。

培養基(ji)的適用性檢查

無(wu)(wu)菌(jun)檢(jian)查(cha)用(yong)的(de)硫乙(yi)醇酸鹽流體(ti)培養(yang)(yang)基(ji)和(he)胰酪大(da)豆胨(dong)液體(ti)培養(yang)(yang)基(ji)等應符(fu)合培養(yang)(yang)基(ji)的(de)無(wu)(wu)菌(jun)性(xing)檢(jian)查(cha)及靈(ling)敏度檢(jian)查(cha)的(de)要求。本檢(jian)查(cha)可(ke)在供試品的(de)無(wu)(wu)菌(jun)檢(jian)查(cha)前(qian)或與(yu)供試品的(de)無(wu)(wu)菌(jun)檢(jian)查(cha)同時進行。

無菌性檢查 每批培養基隨(sui)機取不(bu)少于(yu) 5 支（瓶），置各培養基規定的溫度培養 14 天，應無菌生長(chang)。

靈敏度檢(jian)查

菌(jun)種 培(pei)養(yang)基靈敏(min)度檢(jian)查(cha)所用的菌(jun)株傳代次(ci)數不得超過 5 代（從(cong)菌(jun)種保存 中(zhong)心獲得的干燥菌(jun)種為第 0 代），并(bing)采用適宜的菌(jun)種保藏技術(shu)進行和(he)確(que)認，以保證試驗菌(jun)株的生(sheng)物學(xue)特性。

金黃色葡(pu)萄球菌(jun)(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B)26003〕

銅(tong)綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10104〕

枯草芽(ya)孢桿(gan)菌（Bacillus subtilis）〔CMCC(B)63501〕

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64941〕

白色念(nian)珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98001〕

黑曲霉(Aspergillusniger) 〔CMCC(F) 98003〕

菌液制 備接(jie)種金(jin)黃色(se)葡(pu)萄(tao)球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、銅(tong)綠假單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、枯(ku)草(cao)芽孢桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)新鮮培(pei)養(yang)(yang)物至(zhi)(zhi)胰酪大(da)豆胨液(ye)(ye)體(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)中或(huo)胰酪大(da)豆胨瓊(qiong)脂培(pei)養(yang)(yang)基(ji)上，接(jie)種生孢梭菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)新鮮培(pei)養(yang)(yang)物至(zhi)(zhi)硫乙(yi)醇酸鹽(yan)流體(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)中，30～35℃培(pei)養(yang)(yang) 18～24 小時；接(jie)種白(bai)色(se)念珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)新鮮培(pei)養(yang)(yang)物至(zhi)(zhi)沙(sha)(sha)氏葡(pu)萄(tao)糖液(ye)(ye)體(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)中或(huo)沙(sha)(sha)氏葡(pu)萄(tao)糖瓊(qiong)脂培(pei)養(yang)(yang) 基(ji)上，20～25℃培(pei)養(yang)(yang) 2～3 天，上述培(pei)養(yang)(yang)物用(yong) pH7.0 無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)氯(lv)(lv)化(hua)鈉(na)- 蛋白(bai)胨緩沖液(ye)(ye)或(huo) 0.9%無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)氯(lv)(lv)化(hua)鈉(na)溶(rong)液(ye)(ye)制成(cheng)適宜濃度菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)懸(xuan)(xuan)(xuan)液(ye)(ye)。接(jie)種黑(hei)曲霉至(zhi)(zhi)沙(sha)(sha)氏葡(pu)萄(tao)糖瓊(qiong)脂斜面培(pei)養(yang)(yang)基(ji)或(huo)馬鈴薯葡(pu)萄(tao)糖瓊(qiong)脂培(pei)養(yang)(yang)基(ji)上，20～25℃培(pei)養(yang)(yang) 5～7 天或(huo)直到獲得豐(feng)富的(de)孢子(zi)(zi)，加入適量含 0.05％（ml/ml）聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi) 80 的(de) pH7.0 無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)氯(lv)(lv)化(hua)鈉(na)-蛋白(bai)胨緩沖液(ye)(ye)或(huo) 0.9%無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)氯(lv)(lv)化(hua)鈉(na)溶(rong)液(ye)(ye)，將孢子(zi)(zi)洗脫。然后，采用(yong)適宜的(de)方法吸出(chu)孢子(zi)(zi)懸(xuan)(xuan)(xuan)液(ye)(ye)至(zhi)(zhi)無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)試管(guan)內(nei)，用(yong)含 0.05％（ml/ml）聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi) 80 的(de) pH7.0 無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)氯(lv)(lv)化(hua)鈉(na)-蛋白(bai)胨緩沖液(ye)(ye)或(huo) 0.9%無(wu)(wu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)氯(lv)(lv)化(hua)鈉(na)溶(rong)液(ye)(ye)制成(cheng)適宜濃度的(de)孢子(zi)(zi)懸(xuan)(xuan)(xuan)液(ye)(ye)。菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)懸(xuan)(xuan)(xuan)液(ye)(ye)若在(zai)室(shi)溫下放(fang)置，一般應在(zai) 2 小時內(nei)使用(yong)；若保存(cun)在(zai) 2～8℃可(ke)在(zai) 24 小時內(nei)使用(yong)。黑(hei)曲霉孢子(zi)(zi)懸(xuan)(xuan)(xuan)液(ye)(ye)可(ke)保存(cun)在(zai) 2～8℃，在(zai)驗證過(guo)的(de)貯存(cun)期內(nei)使用(yong)。

培養基接種 取適宜(yi)裝(zhuang)量(liang)的硫乙醇酸(suan)鹽流體培養基 7 支(zhi)(zhi)，分(fen)(fen)別接(jie)種(zhong)不(bu)大于(yu)100cfu的金黃色(se)葡萄球菌、銅綠假單胞(bao)菌、生孢梭(suo)菌各(ge)2支(zhi)(zhi)， 另1支(zhi)(zhi)不(bu)接(jie)種(zhong)作為空(kong)(kong)白(bai)對照，培養不(bu)超過3天；取適宜(yi)裝(zhuang)量(liang)的胰酪大豆胨液體培養基 7 支(zhi)(zhi),分(fen)(fen)別接(jie)種(zhong)不(bu)大于(yu) 100cfu 的枯(ku)草芽孢桿菌、白(bai)色(se)念珠菌、黑曲霉各(ge)2支(zhi)(zhi)，另1支(zhi)(zhi)不(bu)接(jie)種(zhong)作為空(kong)(kong)白(bai)對照，培養不(bu)超過5天。

結(jie)果判(pan)定 空白(bai)對照管應無(wu)菌(jun)生長(chang)，若加菌(jun)的培(pei)養基(ji)管均(jun)生長(chang)良好，判該培(pei)養基(ji)的靈敏度檢查符合(he)規定。

稀釋液、沖洗液及其制備方法

稀釋液、沖洗液配(pei)制后應采用驗證合格的滅菌(jun)程(cheng)序滅菌(jun)。

1. 0.1%無菌蛋白胨水溶液 取(qu)蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微溫溶解，必要時濾(lv)過使澄清(qing)，調節 pH 值至 7.1±0.2，分裝，滅菌。

2. pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀 3.56g，無水磷酸氫二 鈉 5.77g，氯化鈉 4.30g，蛋白胨 1.00g，加水 1000ml，微溫(wen)溶解，必(bi)要(yao)時濾過使澄(cheng)清分裝(zhuang)，滅菌(jun)。

根據供(gong)試品的特性，可選用其他(ta)經驗證的適宜溶液作(zuo)為稀釋液、或沖洗液(如(ru) 0.9%無菌(jun)氯化鈉溶液)。

如需要，可在(zai)上述稀(xi)釋液或(huo)沖(chong)洗(xi)液的滅菌前或(huo)滅菌后加入表(biao)面活性劑(ji)或(huo) 中和劑(ji)等。

方(fang)(fang)法適(shi)用(yong)性(xing)試驗進(jin)行(xing)產品無(wu)菌(jun)檢查(cha)時(shi)，應進(jin)行(xing)方(fang)(fang)法適(shi)用(yong)性(xing)試驗，以確(que)認(ren)所采用(yong)的方(fang)(fang)法適(shi)合于該產品的無(wu)菌(jun)檢查(cha)。若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果(guo)時(shi)， 應重新進(jin)行(xing)方(fang)(fang)法適(shi)用(yong)性(xing)試驗。

方法(fa)適(shi)用性試驗按(an)“供試品(pin)的無菌檢查”的規定(ding)及下(xia)列要(yao)求進行(xing)操作。對每一試驗菌應(ying)逐(zhu)一進行(xing)方法(fa)確認。

菌種及菌液制備 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養基靈敏度檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli ）[CMCC(B) 44102]的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

薄膜過濾法 按供試品的無菌檢查要求取每種培養基規定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入 小 于不大于 100cfu 的試驗菌，過濾。加至濾筒內，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內加硫乙醇酸鹽流體培養基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內加胰 酪大豆 胨液體培養基。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌， 作為對照。置規定溫度培養，培養時間不得超過 5 天。

直接接種法 取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基 6 管，分別接入不大于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭 菌各 2 管，；取符合直接接種法培養基用量要求的胰酪大豆胨液體培養基 6 管， 分別接入不大于100cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2 管。其中 1 管按供試品的無菌檢查要求接入每支培養基規定的供試品接種量，另 1 管作為對照，置規定的溫度培養，培養時間不得超過 5 天。

結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容 器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或 滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適 用性試驗。

方法適用性試(shi)驗也可與(yu)供試(shi)品的無菌(jun)檢查同時進(jin)行(xing)。

供試品的無菌檢查

無菌檢(jian)(jian)查法包括(kuo)薄(bo)膜過(guo)濾法和(he)直接(jie)接(jie)種法。只要(yao)供試品性質允(yun)許，應采(cai)用(yong)(yong)薄(bo)膜過(guo)濾法。供試品無菌檢(jian)(jian)查所采(cai)用(yong)(yong)的(de)檢(jian)(jian)查方法和(he)檢(jian)(jian)驗條件(jian)應與方法適用(yong)(yong)性試驗確認的(de)方法相同(tong)。

無菌(jun)試驗過程中，若需使(shi)用表面活(huo)性劑(ji)、滅活(huo)劑(ji)、中和劑(ji)等試劑(ji)，應證 明其有效性，且對微生物(wu)無毒性。

檢驗數量 檢(jian)驗(yan)數(shu)量(liang)是指一次試(shi)驗(yan)所用供(gong)試(shi)品最(zui)小(xiao)包裝容器的數(shu)量(liang) ，成品 每亞批均應進行無菌檢(jian)查。除另有規(gui)定(ding)外，出廠產(chan)品按表 1 規(gui)定(ding)；上市產(chan)品 監督檢(jian)驗(yan)按表 2 規(gui)定(ding)。表 1、表 2 中最(zui)少(shao)檢(jian)驗(yan)數(shu)量(liang)不包括陽性(xing)對照試(shi)驗(yan)的供(gong)試(shi) 品用量(liang)。

檢驗量 是指供試品(pin)每個(ge)最小包裝接(jie)種至每份培(pei)養基(ji)(ji)的最小量(liang)（g 或 ml）。除另(ling)有(you)規(gui)(gui)定(ding)外,供試品(pin)檢驗(yan)量(liang)按(an)表(biao) 3 規(gui)(gui)定(ding)。若每支（瓶）供試品(pin)的裝量(liang)按(an)規(gui)(gui)定(ding) 足夠接(jie)種兩種培(pei)養基(ji)(ji)，則應(ying)分(fen)別接(jie)種硫乙醇(chun)酸鹽流體培(pei)養基(ji)(ji)和胰酪(lao)大豆胨液 體培(pei)養基(ji)(ji)。采(cai)用薄(bo)膜過(guo)濾法時(shi)，只要(yao)供試品(pin)特性允(yun)許，應(ying)將(jiang)所有(you)容(rong)器內(nei)的內(nei)容(rong)物(wu)全(quan)部過(guo)濾。

陽性對照 應根據供(gong)(gong)試品特(te)性(xing)(xing)選擇陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)：無抑菌(jun)(jun)(jun)(jun)作用(yong)及抗革蘭陽(yang)(yang)性(xing)(xing) 菌(jun)(jun)(jun)(jun)為(wei)主(zhu)的供(gong)(gong)試品，以金(jin)黃色(se)葡萄球菌(jun)(jun)(jun)(jun)為(wei)對(dui)照(zhao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)；抗革蘭陰(yin)性(xing)(xing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)為(wei)主(zhu)的供(gong)(gong)試品， 以大(da)腸埃希菌(jun)(jun)(jun)(jun)為(wei)對(dui)照(zhao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)；抗厭氧菌(jun)(jun)(jun)(jun)的供(gong)(gong)試品，以生(sheng)孢梭菌(jun)(jun)(jun)(jun)為(wei)對(dui)照(zhao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)；抗真菌(jun)(jun)(jun)(jun) 的供(gong)(gong)試品，以白色(se)念珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)為(wei)對(dui)照(zhao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)。陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)試驗的菌(jun)(jun)(jun)(jun)液制備同方法適(shi)用(yong)性(xing)(xing) 試驗，加(jia)菌(jun)(jun)(jun)(jun)量(liang)不(bu)大(da)于 100cfu，供(gong)(gong)試品用(yong)量(liang)同供(gong)(gong)試品無菌(jun)(jun)(jun)(jun)檢查時每份培(pei)養 基接種的樣品量(liang)。陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)管(guan)培(pei)養不(bu)超過 5 天(tian)，應生(sheng)長(chang)良(liang)好。

陰性對照 供試品(pin)無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法(fa)操作， 作為陰(yin)性對照(zhao)。陰(yin)性對照(zhao)不得有菌生長。

供試品處理及接種培養基

操(cao)作時，用適宜的方 法對供(gong)試(shi)品容器(qi)(qi)(qi)表(biao)面進(jin)行徹(che)底消(xiao)毒(du)，如(ru)果供(gong) 試(shi)品容器(qi)(qi)(qi)內(nei)(nei)有一定的真(zhen)空度，可用適宜的無菌器(qi)(qi)(qi)材（如(ru)帶有除(chu)菌過濾器(qi)(qi)(qi)的針 頭）向容器(qi)(qi)(qi)內(nei)(nei)導(dao)入無菌空氣，再按無菌操(cao)作啟開容器(qi)(qi)(qi)取出(chu)內(nei)(nei)容物(wu)。

除另有規定外，按下列方法(fa)進行供試品處(chu)理及接種培養基。

1. 薄膜過濾法

薄膜(mo)過濾(lv)(lv)(lv)法一般應采用(yong)封(feng)閉式薄膜(mo)過濾(lv)(lv)(lv)器 ，根(gen)據供(gong)試品及其溶(rong)劑的特性選擇(ze)濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)材質。無(wu)菌檢查用(yong)的濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)孔徑應不大(da)于 0.45μm。濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)直徑約為(wei) 50mm，若使用(yong)其他尺寸的濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)，應對稀釋液和沖洗液體積進行調整,并(bing)重新驗證。使用(yong)時，應保證濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)在過濾(lv)(lv)(lv)前后的完(wan)整性。

水溶(rong)(rong)性供試液過濾(lv)(lv)前，一(yi)般(ban)(ban)應先(xian)將少量(liang)的(de)沖洗液過濾(lv)(lv)，以(yi)潤濕濾(lv)(lv)膜(mo)。油類(lei)供試品，其濾(lv)(lv)膜(mo)和過濾(lv)(lv)器在使用(yong)前應充分干燥。為(wei)(wei)發揮濾(lv)(lv)膜(mo)的(de)最大過濾(lv)(lv)效率，應注意保(bao)持供試品溶(rong)(rong)液及沖洗液覆(fu)蓋整個(ge)濾(lv)(lv)膜(mo)表(biao)面(mian)。供試液經薄(bo)膜(mo)過濾(lv)(lv)后，若(ruo)需要用(yong)沖洗液沖洗濾(lv)(lv)膜(mo)，每張濾(lv)(lv)膜(mo)每次沖洗量(liang)一(yi)般(ban)(ban)為(wei)(wei) 100ml，總沖洗 量(liang)一(yi)般(ban)(ban)不超過500ml，最高不得超過 1000ml，以(yi)避免濾(lv)(lv)膜(mo)上的(de)微生物受損(sun)傷(shang)。

水溶性液體供試(shi)品取規定量，直接(jie)過濾(lv)(lv)，或(huo)混合至含不少(shao)于 100ml適宜稀釋(shi)液的無菌容器中，混勻，立即過濾(lv)(lv)。如供試(shi)品具有抑(yi)菌作(zuo)用，須用沖洗(xi)液沖洗(xi)濾(lv)(lv)膜，沖洗(xi)次數一般(ban)不少(shao)于三(san)次，所(suo)用的沖洗(xi)量、沖洗(xi)方法(fa)同方 法(fa)適用性試(shi)驗。除(chu)生物制(zhi)品外，一般(ban)樣(yang)品沖洗(xi)后，1份濾(lv)(lv)器加(jia)入 100ml 硫乙醇(chun) 酸(suan)鹽(yan)流體培養(yang)基(ji)，1份濾(lv)(lv)器加(jia)入 100ml 胰酪(lao)大(da)豆胨液體培養(yang)基(ji)。生物制(zhi)品樣(yang)品 沖洗(xi)后，2份濾(lv)(lv)器加(jia)入 100ml 硫乙醇(chun)酸(suan)鹽(yan)流體培養(yang)基(ji)，1份濾(lv)(lv)器加(jia)入 100ml 胰酪(lao)大(da)豆胨液體培養(yang)基(ji)。

水(shui)溶性固體(ti)和半固體(ti)供(gong)試品取(qu)規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽(qian)說明復溶，然后照(zhao)水(shui)溶性液體(ti)供(gong)試品項(xiang)下的方法操作。

非水溶(rong)性(xing)供(gong)試品取規定量，直接(jie)過濾(lv)；或混合溶(rong)于適量含聚(ju)山(shan)(shan)梨酯 80或 其他適宜乳化(hua)劑的(de)(de)(de)稀釋液(ye)(ye)中，充分(fen)混合，立即過濾(lv)。用含 0.1%～1%聚(ju)山(shan)(shan)梨酯 80 的(de)(de)(de)沖(chong)洗液(ye)(ye)沖(chong)洗濾(lv)膜(mo)至少 3 次。加入含或不含聚(ju)山(shan)(shan)梨酯 80 的(de)(de)(de)培養基。接(jie)種(zhong)培養基照水溶(rong)性(xing)液(ye)(ye)體供(gong)試品項下的(de)(de)(de)方法操作。

可溶(rong)于十(shi)四烷(wan)(wan)酸異(yi)(yi)丙酯(zhi)的(de)膏劑和黏性(xing)油(you)劑供試品取(qu)規定量(liang)，混合至(zhi)適(shi)(shi)量(liang) 的(de)無菌十(shi)四烷(wan)(wan)酸異(yi)(yi)丙酯(zhi)中(zhong)，劇烈振(zhen)搖，使(shi)供試品充分(fen)溶(rong)解，如果需要可適(shi)(shi)當加熱(re)(re)，加熱(re)(re)溫度(du)一般不超(chao)過40℃，最高不得超(chao)過44℃，趁熱(re)(re)迅速(su)過濾。對仍然無法(fa)過濾的(de)供試品，于含有適(shi)(shi)量(liang)的(de)無菌十(shi)四烷(wan)(wan)酸異(yi)(yi)丙酯(zhi)中(zhong)的(de)供試液(ye)中(zhong)加入不少于 100ml 的(de)適(shi)(shi)宜稀釋液(ye)，充分(fen)振(zhen)搖萃取(qu)，靜置，取(qu)下(xia)層水(shui)相作 為供試液(ye)過濾。過濾后濾膜沖洗及接種培養基照非水(shui)溶(rong)性(xing)供試品項(xiang)下(xia)的(de)方法(fa)操作。

無菌氣霧劑供試品(pin)取規定(ding)量，采用專用設備將供試品(pin)轉移至封(feng)閉

式薄膜(mo)過濾器(qi)(qi)中。或(huo)(huo)將(jiang)各(ge)容器(qi)(qi)置(zhi)－20℃或(huo)(huo)其(qi)他適(shi)宜溫度(du)冷凍約 1 小(xiao)時，取出(chu)(chu)，迅(xun)(xun)速消毒供(gong)試品(pin)開(kai)啟部(bu)位(wei)或(huo)(huo)閥門(men)。正(zheng)置(zhi)容器(qi)(qi)，用(yong)無(wu)菌(jun)(jun)鋼錐(zhui)或(huo)(huo)針(zhen)樣設備(bei)以無(wu)菌(jun)(jun)操作迅(xun)(xun)速在與容器(qi)(qi)閥門(men)結構相匹配(pei)的適(shi)宜位(wei)置(zhi)鉆(zhan)一小(xiao)孔(kong)，不同容器(qi)(qi)鉆(zhan)孔(kong)大小(xiao)和深度(du)應保持基本一致(zhi)，鉆(zhan)孔(kong)后(hou)應無(wu)明顯拋(pao)射劑拋(pao)出(chu)(chu)。輕輕轉(zhuan)動(dong)容器(qi)(qi)，使拋(pao)射劑緩(huan)緩(huan)釋(shi)出(chu)(chu)。釋(shi)放拋(pao)射劑后(hou)再(zai)無(wu)菌(jun)(jun)開(kai)啟容器(qi)(qi)，并將(jiang)供(gong)試液轉(zhuan)移至無(wu)菌(jun)(jun)容器(qi)(qi)中混合，必要時用(yong)沖洗(xi)液沖洗(xi)容器(qi)(qi)內壁。供(gong)試品(pin)亦(yi)可采用(yong)其(qi)它(ta)適(shi)宜的方法(fa)取出(chu)(chu)。然后(hou)照水溶(rong)性(xing)液體供(gong)試品(pin)或(huo)(huo)非水溶(rong)性(xing)供(gong)試品(pin)項下(xia)的方法(fa)操作。

裝(zhuang)有(you)藥物(wu)的(de)(de)(de)(de)注射器供(gong)(gong)試(shi)品取規定量，將注射器中的(de)(de)(de)(de)內容物(wu)（若需要可吸(xi)入稀釋液(ye)或(huo)標簽所(suo)示的(de)(de)(de)(de)溶(rong)劑溶(rong)解）直接(jie)過(guo)濾，或(huo)混合至含適宜稀釋液(ye)的(de)(de)(de)(de)無菌(jun)容器中，然后照水(shui)溶(rong)性液(ye)體或(huo)非(fei)水(shui)溶(rong)性供(gong)(gong)試(shi)品項下方法(fa)操作(zuo)。同時應采用適宜的(de)(de)(de)(de)方法(fa)對(dui)包裝(zhuang)中所(suo)配(pei)帶的(de)(de)(de)(de)針頭等(deng)要求無菌(jun)的(de)(de)(de)(de)部件進行無菌(jun)檢查(cha)。

具有(you)導管(guan)的(de)(de)醫療器(qi)械(xie)(輸血、輸液袋(dai)等)供(gong)試品(pin)除另有(you)規定(ding)外，取(qu)規定(ding)量，每個最小包(bao)裝用適(shi)量的(de)(de)（通(tong)常(chang) 50～100ml）沖洗液分別沖洗內壁(bi)，收集沖洗液于(yu)無菌(jun)(jun)容(rong)器(qi)中(zhong)，然后照水(shui)溶(rong)性液體供(gong)試品(pin)項下方法操作。同時應采用適(shi)宜(yi)的(de)(de)方法對(dui)包(bao)裝中(zhong)所配帶的(de)(de)針頭等要(yao)求無菌(jun)(jun)的(de)(de)部件(jian)進行(xing)無菌(jun)(jun)檢查。

2. 直接接種法

直接(jie)(jie)接(jie)(jie)種法適(shi)用(yong)于無(wu)法用(yong)薄膜(mo)過濾法進行無(wu)菌檢(jian)查的(de)(de)(de)供(gong)(gong)(gong)試品(pin)，即(ji)取(qu)規定量供(gong)(gong)(gong)試品(pin)分別等(deng)量接(jie)(jie)種至硫乙(yi)醇(chun)酸(suan)(suan)(suan)鹽流體(ti)(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)和(he)(he)胰(yi)酪大豆胨液(ye)體(ti)(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)中。除(chu)生(sheng)物(wu)制品(pin)外(wai)(wai)，一般樣(yang)品(pin)無(wu)菌檢(jian)查時兩種培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)接(jie)(jie)種的(de)(de)(de)瓶(ping)或支數(shu)(shu)相等(deng)；生(sheng)物(wu)制品(pin)無(wu)菌檢(jian)查時硫乙(yi)醇(chun)酸(suan)(suan)(suan)鹽流體(ti)(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)和(he)(he)胰(yi)酪大豆胨液(ye)體(ti)(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)接(jie)(jie)種的(de)(de)(de)瓶(ping)或支數(shu)(shu)為(wei) 2：1。除(chu)另(ling)有規定外(wai)(wai)，每(mei)個容(rong)器中培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)用(yong)量應(ying)符合接(jie)(jie)種的(de)(de)(de)供(gong)(gong)(gong)試品(pin) 體(ti)(ti)積(ji)不得大于培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)體(ti)(ti)積(ji)的(de)(de)(de) 10%，同時，硫乙(yi)醇(chun)酸(suan)(suan)(suan)鹽流體(ti)(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)每(mei)管裝量不少(shao)于 15ml，胰(yi)酪大豆胨液(ye)體(ti)(ti)培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)每(mei)管裝量不少(shao)于 10ml。供(gong)(gong)(gong)試品(pin)檢(jian)查時，培(pei)養(yang)(yang) 基(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)用(yong)量和(he)(he)高度(du)同方法適(shi)用(yong)性(xing)試驗。

注：①無菌(jun)(jun)十四烷酸(suan)異丙酯的制備可采(cai)用薄膜過(guo)濾法過(guo)濾除菌(jun)(jun),選(xuan)用孔徑為 0.22μm 的適宜濾膜，或其(qi)他適宜的滅(mie)菌(jun)(jun)方法。

混懸液等(deng)非澄清水溶(rong)性液體供試品 取規定量，等(deng)量接種至各管培養基(ji)中。

固體供試品(pin)取規(gui)定量(liang)，直接(jie)(jie)等量(liang)接(jie)(jie)種至(zhi)(zhi)各(ge)管培養(yang)基中(zhong)，或加(jia)入適(shi)宜的溶(rong)劑溶(rong)解，或按標簽說明(ming)復溶(rong)后，取規(gui)定量(liang)等量(liang)接(jie)(jie)種至(zhi)(zhi)各(ge)管培養(yang)基中(zhong)。

非水溶性供試品取(qu)規(gui)定量(liang)，混合(he)，加(jia)入適量(liang)的聚山梨(li)酯(zhi) 80 或其它(ta)適宜的乳化(hua)劑(ji)及稀(xi)釋劑(ji)使其乳化(hua)，等量(liang)接種至(zhi)各(ge)管(guan)培養基中。或直接等量(liang)接種至(zhi)含聚山梨(li)酯(zhi) 80 或其它(ta)適宜乳化(hua)劑(ji)的各(ge)管(guan)培養基中。

敷料供試品取規定(ding)數(shu)量，以(yi)無菌操作拆開每個包裝，于(yu)不(bu)同部位剪取約 100mg 或(huo) 1cm×3cm 的(de)供試品，等(deng)量接種于(yu)各管足(zu)以(yi)浸沒供試品的(de)適量培養基(ji)中。

腸線(xian)、縫合(he)線(xian)等(deng)(deng)供試品腸線(xian)、縫合(he)線(xian)及其它一次(ci)性使用的醫用材(cai)料按(an)規定量(liang)取(qu)最(zui)小包裝，無(wu)菌(jun)拆開(kai)包裝，等(deng)(deng)量(liang)接(jie)種于各管(guan)足以(yi)浸沒供試品的適(shi)量(liang)培(pei)養基中。

滅菌醫用器械供試品除(chu)另有規(gui)定(ding)外(wai)，取規(gui)定(ding)量，必要時應(ying)將其拆散或(huo)切成小碎段，等量接種于各管(guan)足以浸沒供試品的適量培養基中。

放射性(xing)藥(yao)品取供試品 1 瓶(支)，等量(liang)(liang)接(jie)種于裝量(liang)(liang)為 7.5ml 的硫乙醇酸鹽 流體(ti)培養基和胰酪(lao)大(da)豆胨液體(ti)培養基中。每管接(jie)種量(liang)(liang)為 0.2ml。

培養及觀察

將上述接(jie)(jie)(jie)種(zhong)(zhong)供(gong)(gong)試(shi)品(pin)(pin)后(hou)的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)容(rong)(rong)器分別(bie)按(an)各培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)規定(ding)的(de)溫度培(pei)養(yang)(yang)(yang)不(bu)少于 14 天(tian)；接(jie)(jie)(jie)種(zhong)(zhong)生物制品(pin)(pin)的(de)硫乙(yi)醇酸(suan)鹽(yan)流體培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)容(rong)(rong)器應分成兩(liang)等份， 一(yi)(yi)份置(zhi) 30～35℃培(pei)養(yang)(yang)(yang)，一(yi)(yi)份置(zhi) 20～25℃培(pei)養(yang)(yang)(yang)。培(pei)養(yang)(yang)(yang)期間應定(ding)期觀察(cha)并(bing)記錄是(shi)否(fou)有(you)菌(jun)生長。如在加入供(gong)(gong)試(shi)品(pin)(pin)后(hou)或在培(pei)養(yang)(yang)(yang)過程中，培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)出(chu)現(xian)渾濁，培(pei)養(yang)(yang)(yang) 14 天(tian)后(hou)，不(bu)能(neng)從外觀上判斷(duan)有(you)無(wu)微生物生長，可取該(gai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)不(bu)少于 1ml轉種(zhong)(zhong)至(zhi)同種(zhong)(zhong)新(xin)(xin)鮮培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)中，將原始培(pei)養(yang)(yang)(yang)物和新(xin)(xin)接(jie)(jie)(jie)種(zhong)(zhong)的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)繼續(xu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)不(bu)少 于4 天(tian)，觀察(cha)接(jie)(jie)(jie)種(zhong)(zhong)的(de)同種(zhong)(zhong)新(xin)(xin)鮮培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)是(shi)否(fou)再出(chu)現(xian)渾濁；或取培(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)涂片，染色，鏡(jing)檢，判斷(duan)是(shi)否(fou)有(you)菌(jun)。

結果判斷

陽性對照管(guan)應生(sheng)(sheng)長良好，陰(yin)性對照管(guan)不得有菌(jun)生(sheng)(sheng)長。若供試品管(guan)均澄清，或雖顯渾濁(zhuo)但經確(que)證(zheng)無菌(jun)生(sheng)(sheng)長，判供試品符合規(gui)定；

若供(gong)(gong)試(shi)品管中任何一管顯渾濁(zhuo)并(bing)確證有菌生(sheng)長，判(pan)供(gong)(gong)試(shi)品不(bu)符合規定，除(chu)非(fei)能充分證明試(shi)驗結(jie)果無效，即生(sheng)長的微生(sheng)物非(fei)供(gong)(gong)試(shi)品所含。當符合下列至少(shao) 一個條件時方可認為試(shi)驗結(jie)果無效：

（1）無菌(jun)檢查試驗所用的(de)設(she)備及(ji)環(huan)境的(de)微生物(wu)監控(kong)結(jie)果不(bu)符合無菌(jun)檢查法的(de)要求。

（2）回顧無菌試驗過(guo)程，發現有可能(neng)引起微生(sheng)物污(wu)染的(de)因素。

（3）在陰性對照中觀(guan)察(cha)到(dao)微生物生長。

（4） 供試品(pin)管(guan)中生長的微生物(wu)經鑒定(ding)后，確證是因無菌試驗中所(suo)使用的物(wu)品(pin)和(he)（或）無菌操作技術不當引(yin)起的。

試驗若(ruo)經(jing)確(que)認(ren)無(wu)(wu)效，應重(zhong)試。重(zhong)試時，重(zhong)新取同(tong)量供(gong)試品(pin)，依法檢查， 若(ruo)無(wu)(wu)菌生長，判供(gong)試品(pin)符(fu)合(he)規(gui)定(ding)；若(ruo)有菌生長，判供(gong)試品(pin)不符(fu)合(he)規(gui)定(ding)。

轉自：GMP辦公(gong)(gong)室公(gong)(gong)眾微(wei)信(xin)號