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發布時間：2023-04-04 10:39 信(xin)息來源： 閱讀(du)次數： 次
CAR-T細胞療法(fa)
免疫細胞療法廣泛應用于臨床，尤其是惡性腫瘤，是指采集人體自身免疫細胞，經過體外改造、培養，使其數量擴增或增加其靶向殺傷能力，然后再回輸到患者體內，達到殺滅血液及組織中病原體、腫瘤細胞的目的。
CAR-T細胞治療技術因其安全性和廣泛適用性，成為近年來一種發展較快的抗腫瘤治療技術，但實際應用中，以逆轉錄病毒或慢病毒為載體的CAR-T細胞治療產品，也仍然存在一定安全隱患，其主要原因在于，作為載體的逆轉錄病毒或慢病毒仍有可能產生具體有復制能力的病毒，即產生復制性逆轉錄病毒（replication competent retroviruses，RCR）或產生復制性慢病毒（replication competent lentivirus, RCL）。
潛(qian)在風(feng)險
逆轉錄病(bing)毒(du)載體(ti)(ti)(ti)和慢(man)病(bing)毒(du)載體(ti)(ti)(ti)均為復制(zhi)缺陷(xian)型載體(ti)(ti)(ti)，但(dan)在病(bing)毒(du)載體(ti)(ti)(ti)生(sheng)產過(guo)程中因穿梭載體(ti)(ti)(ti)、包(bao)裝(zhuang)載體(ti)(ti)(ti)及(ji)包(bao)裝(zhuang)細胞(bao)中的內源(yuan)性逆轉錄元(yuan)件(jian)之間(jian)，或病(bing)毒(du)載體(ti)(ti)(ti)與(yu)免(mian)疫細胞(bao)的內源(yuan)性逆轉錄元(yuan)件(jian)之間(jian)發生(sheng)同源(yuan)或非同源(yuan)重(zhong)組，會導致可復制(zhi)慢(man)病(bing)毒(du)(replication competent lentivirus，RCL)產生。鑒(jian)于RCL潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)威(wei)脅，FDA及歐盟先(xian)后出臺了相(xiang)關文件，要求在(zai)生產及應用的(de)(de)(de)不同階段進(jin)(jin)行RCL的(de)(de)(de)控制，包括(kuo)生產病毒的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)庫、終(zhong)末細(xi)胞(bao)、病毒載體及轉導細(xi)胞(bao)，并(bing)對CAR-T細(xi)胞(bao)回(hui)輸后的(de)(de)(de)患者個(ge)體進(jin)(jin)行監測。
現有(you)技術(shu)中，RCL的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)主要包括(kuo)針對(dui)特定(ding)(ding)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（如vsv-g基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)、psi-gag基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)）的(de)(de)pcr法(fa)(fa)(fa)(fa)或qpcr法(fa)(fa)(fa)(fa)快(kuai)檢(jian)(jian)技術(shu)以及敏(min)(min)(min)感(gan)細(xi)胞(bao)感(gan)染試(shi)驗法(fa)(fa)(fa)(fa)等(deng)。為(wei)了提(ti)高試(shi)驗的(de)(de)靈敏(min)(min)(min)度，FDA推薦(jian)利用(yong)(yong)以細(xi)胞(bao)培養(yang)(yang)為(wei)基(ji)(ji)礎的(de)(de)感(gan)染性(xing)(xing)試(shi)驗進(jin)行RCL的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)，該方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)首先將可能(neng)存在(zai)(zai)的(de)(de)RCL在(zai)(zai)敏(min)(min)(min)感(gan)細(xi)胞(bao)上(shang)擴增，并(bing)在(zai)(zai)培養(yang)(yang)終點利用(yong)(yong)敏(min)(min)(min)感(gan)、快(kuai)速的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)進(jin)行檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)。在(zai)(zai)細(xi)胞(bao)擴增及指示(shi)階段需設置陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)、陽(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)以及抑制對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)組。陽(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)一般為(wei)減毒的(de)(de)HIV-1，抑制對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)是在(zai)(zai)供(gong)試(shi)品(pin)中加入一定(ding)(ding)量(liang)的(de)(de)減毒HIV-1，以排除實驗用(yong)(yong)量(liang)供(gong)試(shi)品(pin)可能(neng)會對(dui)C8166細(xi)胞(bao)的(de)(de)生(sheng)長或感(gan)染產生(sheng)抑制而出現RCL假陰(yin)性(xing)(xing)結果。經過培養(yang)(yang)的(de)(de)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)組及供(gong)試(shi)樣(yang)品(pin)最終采用(yong)(yong)ELISA法(fa)(fa)(fa)(fa)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)p24含(han)量(liang)、PCR／Q-PCR法(fa)(fa)(fa)(fa)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)psi-gag和(he)VSV-G序列、測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)逆(ni)轉錄酶活性(xing)(xing)（PERT法(fa)(fa)(fa)(fa)）等(deng)方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)RCL。
珈創生物RCL檢測服務
珈創生(sheng)物(wu)(wu)構建了HIV-1弱毒質粒，包裝(zhuang)了HIV-1弱毒作為RCL實(shi)驗(yan)(yan)的(de)(de)(de)陽性對(dui)(dui)照病(bing)毒，并(bing)對(dui)(dui)陽性對(dui)(dui)照與抑制對(dui)(dui)照中(zhong)HIV-1弱毒的(de)(de)(de)添(tian)加(jia)(jia)(jia)量(liang)進(jin)行(xing)摸索，使用合適添(tian)加(jia)(jia)(jia)量(liang)，以(yi)驗(yan)(yan)證(zheng)反應體系(xi)的(de)(de)(de)適用性，又能(neng)監測(ce)(ce)(ce)反應靈敏度(du)。同(tong)時，對(dui)(dui)供(gong)試品(pin)（慢病(bing)毒終(zhong)(zhong)末細(xi)胞、慢病(bing)毒上清(qing)液、CAR-T轉導細(xi)胞）添(tian)加(jia)(jia)(jia)量(liang)也進(jin)行(xing)實(shi)驗(yan)(yan)，以(yi)確保供(gong)試品(pin)不會明顯影響C8166敏感細(xi)胞的(de)(de)(de)增殖和(he)(he)感染(ran)。供(gong)試品(pin)在C8166細(xi)胞中(zhong)經過(guo)擴(kuo)增階(jie)段和(he)(he)指(zhi)示(shi)階(jie)段的(de)(de)(de)培養后(hou)，感染(ran)終(zhong)(zhong)點的(de)(de)(de)細(xi)胞上清(qing)將進(jin)行(xing)p24 Elisa檢測(ce)(ce)(ce)；同(tong)時細(xi)胞將用來(lai)提取DNA，進(jin)行(xing)psi-gag和(he)(he)VSV-G基因qPCR檢測(ce)(ce)(ce)（引(yin)物(wu)(wu)探(tan)針由本公司(si)自行(xing)設計(ji)）。本公司(si)建立的(de)(de)(de)RCL檢測(ce)(ce)(ce)方法經過(guo)方法驗(yan)(yan)證(zheng)，可滿足不同(tong)類型供(gong)試品(pin)的(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)(ce)需求。
后(hou)臺回復“RCL檢測”，咨詢相關服務。
生物制品(pin)病毒安(an)全性相關法規(gui)
中國
（5）體外基因修飾系(xi)統藥學(xue)研究(jiu)與評價技術指導原(yuan)則(ze)（試(shi)行(xing)）2022
美國
歐(ou)洲
珈創生物針對“RCL檢測”，正在拓展相關檢(jian)測服務(wu)，歡迎新老客(ke)戶前來(lai)咨詢。
參(can)考文獻：
[1] 國家藥品監督管理(li)局藥品審(shen)評(ping)中心，體外基因(yin)修(xiu)飾系統藥學(xue)研究與評(ping)價技術指導原則（試行）, 2022.
[2] FDA．Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up［EB/OL］(2018 )．
[3] EMA. Guideline on quality，non-clinical and clinical requirements for investigational advanced therapy medicinal products in clinical trials［EB/OL］．(2019)．
[4] Naldini L, Bl?mer U, Gallay P,etc. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7. PubMed PMID: 8602510.
[5] 萬海粟,周清華.慢病毒載體及其研究進展[J].中國肺癌雜志,2014,12(17):12.DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.12.09.
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